小鼠免疫
小鼠免疫器官实验心得
小鼠免疫器官实验心得步骤：1、准备等体积PBS 含25～100 μg 抗原和弗氏完全佐剂的乳化液（200～400 μl/鼠）。
用双头带塞的连接器连接两个注射器，一个注射器装抗原，另一个装佐剂。
来回推压注射器，使得其内容物从一侧到另一侧注射器，推压 5～10 min 直到得到稳定的乳化液。
2、用 22－G 的针给小鼠腹腔注射（每一个抗原 3～5 只小鼠）。
3、3 周后，用等体积的含 10～50 μg 抗原的 PBS 和不完全弗氏佐剂配制成（200～400 μl）的乳化液再次腹腔注射。
4、第二次免疫后 7 天，用无菌剪刀或剃毛刀片切掉小鼠尾巴0、5 cm 采血。
收集 100～200 μl 血装于1、5 ml 的微量离心管。
将小鼠放在产热灯下 30～60 s 保暖或用拇指和食指挤压尾巴可以方便采血。
5、血块形成后，用木制涂棒把血块从管和表面移走，不要弄破血块。
移走血块后，用200μl 的移液器把血清装入另一微量离心管。
经 ELISA 确定血清抗体滴度。
如有需要，用免疫印迹，进一步对抗体定性。
6、如果滴度太低不能用于融合（≥1/1000），每两周给小鼠加强免疫直至达到足够的应答。
如果采血超过 3 次，用剃毛刀切开一侧尾静脉采血。
7、当抗体滴度足够高时（≥1/1000），融合前3 天，但要在前一次免疫的 2 周后，用含 10～50 μg 抗原的 PBS 溶液腹腔注射（200～400μl）或经皮下尾静脉（50～100μl）注射加强免疫。
8、在强化免疫的 3 天后进行细胞融合。
心得：1、免疫防御（Immunological defence)：是机体排斥外来抗原性异物的一种免疫保护功能。
正常：可产生抗感染的作用(清除病原微生物及其他抗原)；异常：应答过强或持续时间过长——超敏反应；应答过弱——免疫缺陷疾病。
2、免疫监视（Immunological surveillance）：指免疫系统及时识别、清除体内突变、畸变和病毒感染细胞的一种生理保护作用。
影响小鼠免疫功能的因素
影响小鼠免疫功能的因素
影响小鼠免疫功能的因素包括：
1. 遗传因素：小鼠的免疫功能受到遗传因素的调控。
不同品种的小鼠可能具有不同的免疫功能表现，对某些疾病具有不同的易感性。
2. 年龄：小鼠的免疫功能在不同的年龄段会有差异。
幼年小鼠的免疫系统尚未完全发育，因此对感染更易感。
老年小鼠的免疫功能可能会下降，导致免疫应答能力减弱。
3. 环境因素：小鼠所处的环境条件也会对其免疫功能产生影响。
例如，温度、湿度、噪音、光照等环境因素可能会影响小鼠的免疫功能。
4. 饮食因素：小鼠的饮食对其免疫功能有着重要的影响。
缺乏某些营养素或摄入过多的某些营养素都可能导致免疫功能异常。
5. 疾病状态：小鼠患有某些疾病时，其免疫功能可能会受到影响。
例如，感染病原体或患有某些免疫缺陷性疾病可能导致免疫功能降低。
6. 应激因素：小鼠的免疫功能可能会受到应激因素的影响。
例如，压力、药物、放射线等应激刺激可能导致小鼠的免疫功能下降。
7. 其他环境因素：如接触到化学物质、毒素以及感染病原体等，都可能对小鼠免疫功能产生影响。
单抗制备小鼠免疫SOP
单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
小鼠免疫功能检测建立小鼠免疫功能低下模型的研究
小鼠免疫功能检测建立小鼠免疫功能低下模型的研究小鼠免疫功能检测是评估小鼠免疫系统状态的重要手段之一、小鼠作为常用的动物模型，在研究免疫相关疾病、发展新药和疫苗等方面具有广泛应用。
建立小鼠免疫功能低下模型可以为进一步研究免疫功能的途径提供重要参考。
本文将介绍建立小鼠免疫功能低下模型的研究。
首先，建立小鼠免疫功能低下模型需要选择合适的免疫抑制方法。
常用的方法包括药物免疫抑制、单克隆抗体介导的免疫抑制和基因敲除等。
其中，药物免疫抑制是最常用的方法之一、糖皮质激素是目前最常用的免疫抑制药物之一，常用的剂量为每天20-40 mg/kg体重的甲泼尼龙。
免疫抑制剂如环孢素A和他克莫司也可以应用于建立免疫功能低下模型。
此外，通过单克隆抗体特异性抑制免疫应答也是另一种选择。
例如，通过注射CD4或CD8特异性单克隆抗体可抑制小鼠的T细胞功能。
此外，基因敲除技术也可以通过敲除免疫相关基因来建立小鼠免疫功能低下模型。
其次，建立免疫功能低下模型后需要对小鼠的免疫功能进行评估。
评估免疫功能的方法包括机体免疫指标的检测和特定病原体感染模型的建立。
机体免疫指标的检测可以通过检测外周血白细胞数目、淋巴细胞亚群的分布和功能等来评估小鼠的免疫功能。
此外，还可以通过ELISA、免疫荧光或流式细胞术等技术检测小鼠体内的免疫球蛋白水平和细胞因子水平等指标。
特定病原体感染模型的建立可以通过注射特定病原体来评估小鼠免疫功能。
例如，通过感染流感病毒来评估小鼠的免疫功能。
最后，通过研究免疫功能低下模型可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病的治疗和药物设计提供重要参考。
通过建立小鼠免疫功能低下模型，可以在影响免疫功能的基因和通路上进行深入研究，从而揭示免疫功能低下的机制。
此外，还可以利用这些模型开展新药和疫苗的研发，评估其免疫功能调节作用。
总之，小鼠免疫功能检测和建立免疫功能低下模型对于研究免疫系统的功能和调节机制具有重要意义。
通过评估小鼠免疫功能和建立免疫功能低下模型，可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病治疗和药物设计提供重要参考。
小鼠免疫细胞分型
小鼠免疫细胞分型小鼠免疫细胞分型是一项重要的实验技术，用于研究小鼠的免疫系统及其对不同病原体的应答。
免疫细胞是指在免疫反应中起关键作用的细胞类型，包括巨噬细胞、树突细胞、T细胞和B细胞等。
通过对这些免疫细胞的分型和表型分析，可以深入了解小鼠免疫系统的结构和功能，为研究免疫相关疾病提供理论基础和实验依据。
免疫细胞的分型主要依据细胞表面标记分子的表达情况来进行。
表面标记分子是免疫细胞特异性表达的蛋白分子，通过与免疫细胞表面的抗原结合，参与免疫反应的启动和调节。
通过采用流式细胞术、免疫组织化学染色等技术，可以标记和分析免疫细胞表面标记分子的表达情况，从而进行免疫细胞的分型。
巨噬细胞是免疫系统的重要成分，其主要功能是吞噬和消化病原体、清除细胞垃圾等。
巨噬细胞可通过表面标记分子的表达情况进一步分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。
M1型巨噬细胞主要参与炎症反应，表面标记分子包括CD86、CD16/CD32等；而M2型巨噬细胞主要参与抗炎反应和修复过程，表面标记分子包括CD206、F4/80等。
通过分型巨噬细胞，可以更加深入地了解巨噬细胞在不同免疫环境中的功能调控和信号通路。
树突细胞是免疫系统中的抗原递呈细胞，起着激活和调控T细胞免疫应答的重要作用。
树突细胞通过表面标记分子的表达情况分为CD11c阳性的传统树突细胞和CD11c阴性的组织树突细胞。
传统树突细胞主要存在于淋巴组织和周围组织中，表面标记分子包括CD11c、CD40等；而组织树突细胞主要存在于多种组织器官中，表面标记分子包括SIRP-α、CD103等。
树突细胞的分型可以帮助我们更好地了解树突细胞在不同免疫环境中的分化和功能特点。
T细胞和B细胞是抗原特异性免疫细胞，对抗原进行识别和应答。
根据细胞表面标记分子的表达情况，T细胞可分为CD4阳性的辅助T细胞和CD8阳性的细胞毒性T细胞。
辅助T细胞起到激活和调控免疫应答的作用，可通过表面标记分子CD4、CD25、CD69等进行鉴定；而细胞毒性T细胞具有直接杀伤病原体和肿瘤细胞的能力，可通过表面标记分子CD8、CD44、CD62L等进行鉴定。
小鼠免疫方案
小鼠免疫方案1.将抗原蛋白溶于生理盐水中（可以溶解为0.2mg/mL的抗原溶液）；1.1. 与等体积的弗氏完全佐剂双推法混匀（此时抗原浓度约0.1mg/mL）；1.2 经腹部皮下多点注射免疫BALB/C小鼠(注射约0.25mL)；1.3 2周后用等量抗原与不完全弗氏佐剂同上法混匀后免疫；1.4 再过1周后连续每周用以上1.3.的方法加强免疫1次(抗原可减半)，共3次；1.4 最后一次免疫3d后，可通过断尾取血测血清效价，若达到预期目的，即可放血收集抗血清。
2.20-100ug/mouse3.用正常小鼠的血清做阴性对照4.初步实验方案如下：小鼠眼球采血500ul，将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。
抗血清稀释度：1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：128001.抗原包被板子，10ug/ml,0.1ml/孔，4°包被过夜2、洗涤：每孔250ul洗涤液。
洗三次。
3、封闭：每孔200ul封闭液，37摄氏度1小时。
洗涤液,封闭液和包被液均是含0.1%吐温的PBST4、加入抗体，按比例稀释，每孔100ul，37度1小时。
5、洗涤：同上，5次。
6、加二抗：每孔100ul，37度1小时，洗涤5次。
（这部洗涤比较关键，必须洗干净，否则OD值偏高。
如果拍板熟练，也可以不用洗涤）7、显色：加入底物和供氢体。
分别50ul 避光显色15min8、终止：2mol/L硫酸50ul/孔9、测定：用酶标仪测450nm的OD 值。
免疫小鼠的基本操作方法
免疫小鼠的基本操作方法免疫小鼠是一种被广泛应用于免疫学研究中的实验动物模型。
以下是关于免疫小鼠基本操作方法的详细介绍。
1. 小鼠品系选择：选择适合免疫学研究的小鼠品系。
常用的免疫小鼠品系有C57BL/6、BALB/c、DBA/2等。
对于特定研究目的，也可以选择具有特定基因突变（如敲除基因、转基因等）的小鼠品系。
2. 小鼠的饲养条件：提供适宜的饲养环境和营养，确保小鼠的健康和免疫状态。
小鼠饲养箱应该具备适当温度和湿度，并保持适当的光照周期。
小鼠的饲料应该是高质量的小鼠饲料，并且要保持洁净，及时更换。
3. 小鼠的免疫准备：为了进行免疫实验，需要在小鼠体内引起免疫反应。
为此，可以通过免疫接种或免疫注射的方式使小鼠免疫。
例如，免疫接种可以使用病毒、细菌或真菌等病原体，通过皮下、肌肉或腹腔注射的方式进行。
免疫注射可以使用蛋白质抗原或多肽，通过皮下或腹腔注射的方式进行。
4. 小鼠的免疫监测：在进行免疫实验后，需要对小鼠的免疫状态进行监测。
可以通过体重变化、疾病症状、抗体产生、细胞免疫等指标进行评估。
常用的监测方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术等。
5. 小鼠的体外实验：使用免疫小鼠进行免疫学研究时，常常需要进行一系列的体外实验。
这些实验包括细胞培养、细胞增殖、细胞凋亡、细胞因子检测、基因表达等。
体外实验所需的实验材料可以是小鼠淋巴细胞、脾细胞、巨噬细胞等。
6. 小鼠的体内实验：除体外实验外，还可以使用免疫小鼠进行体内实验，以研究免疫应答的机制。
这些实验包括感染模型、移植模型、自身免疫模型等。
体内实验可以通过采集血液、器官组织、淋巴结等样本来进行分析。
7. 小鼠的人道处理：在使用免疫小鼠进行研究时，必须严格遵守实验动物使用的伦理规范。
应该对小鼠给予充分的关爱和保护，合理安排实验操作，避免对小鼠造成不必要的伤害和痛苦。
在实验结束后，应该适时进行安乐死处理，以减少小鼠的痛苦。
以上是关于免疫小鼠的基本操作方法的详细介绍。
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察【实验原理】免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。
中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。
各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。
【试剂和器材】小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛【操作方法】1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。
2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。
3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。
【结果观察】小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察【注意事项】1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。
2.脾脏分离完整，清研轻柔。
3.染色时间不宜过长或过短。
.【讨论】脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。
1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～2.4 %。
虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。
脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。
同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。
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小鼠免疫
免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。
即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。
一、血清效价的影响因素
小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。
单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。
二、免疫材料
1．免疫用的动物
抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。
小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。
2．免疫原（抗原）
颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、•细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。
可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，•应先制备成人工免疫原，再加佐剂。
免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体
更合适。
一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。
且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。
3．佐剂
目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。
种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。
弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。
三、免疫策略
1．免疫途径
途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。
有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。
脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。
脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。
一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
2．免疫方案
典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。
第一次，弱抗体反应，主要是低亲和力的lgM抗体为主
第二次，产生增强的体液免疫，加强免疫产生的抗体中lgG数量明显增多。
能刺激免疫应答的成熟，进一步扩增抗原反应性B细胞的数量，增加血
清抗体的效价。
6-10天，测效价。
血清效价定义：在任何筛选试验中均能和抗原出现明显的、可检测到的反应的血清最大稀释度的倒数。
至少＞1:1000。
通常，低血清效价的动物，得到克隆的概率低，并且通常是分泌lgM抗体，在这种情况下，可以改变抗原的形式，或者所以佐剂种类。
若使用CFA/IFA佐剂不能产生有效免疫应答的抗原，在换用明矾作为佐剂后可能大大提高免疫原性。
血清有效价＞1:1000后，应休息3-6周，为了让增强的二次应答衰减，以便在最后一次接触抗原后导致新的B细胞的活化和扩增。
融合前的冲击免疫，抗原用生理盐水或者PBS稀释，不含佐剂。
最有效途径是静脉注射，可以将抗原直接输送到脾脏，脾脏中新活化的B母细胞收获后可用于做融合。
如果不适合静脉注射（颗粒状或者缓冲液有毒），可腹腔注射。
静脉注射冲击3天，腹腔4天后融合。
四、免疫失败的原因及措施
（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量；
（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法；
（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进；
（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化；
（5）免疫的方法、剂量，加强免疫间隔时间和次数，免疫的途径是否合适；
（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。