小鼠免疫组织及免疫细胞的观察
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数【实验⽬的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法，并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养；2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤；3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法；4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在⽆菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的⽣理环境，使离体的细胞在体外⽣长和繁殖，并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在⽆菌条件下，⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法，将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度，形成致密的单层细胞时，⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞，从⼀个容器中以1：2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
⾼等⽣物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究，则要⽅便和简单得多。
被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律，探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制，也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段，被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因⼦分析；便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察；在⽣物学的各个领域（如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被⼴泛应⽤。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。
免疫组化实验报告
免疫组化实验报告免疫组化实验报告免疫组化实验是一种常用于生物医学研究领域的技术，它通过利用抗体与特定抗原的结合来检测和定位细胞或组织中的特定蛋白质。
本次实验旨在探究免疫组化实验的原理、步骤以及在疾病诊断和治疗中的应用。
一、实验原理免疫组化实验基于免疫学的原理，即利用机体免疫系统产生的抗体与特定抗原结合的特异性。
在实验中，首先需要制备特定抗原的抗体，通常通过免疫动物（如小鼠）注射抗原，使其产生特异性抗体。
然后，将这些抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，通过标记抗体的方法来检测和定位特定蛋白质。
二、实验步骤1. 细胞或组织的固定和切片：首先，将待检测的细胞或组织样本固定在载玻片上，常用的固定剂有甲醛、乙醛等。
然后，将固定的样本进行切片处理，通常使用微型切片机或手工切片刀进行切片。
2. 抗体的制备和标记：制备特定抗原的抗体是实验的关键步骤之一。
通常，将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，使其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物的血清中提取抗体。
为了方便检测和定位，可以将这些抗体标记上荧光染料或酶等物质。
3. 抗体与样本的反应：将标记好的抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，使抗体与特定蛋白质结合。
这一步通常需要在适当的温度和时间条件下进行，以确保反应的充分和特异性。
4. 反应产物的可视化：根据抗体标记的方式不同，可采用不同的方法来可视化反应产物。
如果是标记了荧光染料的抗体，可以使用荧光显微镜观察样本；如果是标记了酶的抗体，可以使用底物与酶的反应产生颜色变化，再通过显微镜观察。
三、实验应用免疫组化实验在疾病诊断和治疗中具有广泛的应用价值。
例如，在肿瘤学中，通过检测肿瘤标志物的表达情况，可以帮助医生确定肿瘤的类型、分级和预后。
此外，免疫组化实验还可用于研究疾病的发生机制、筛选新的治疗靶点以及评估药物疗效。
在临床诊断中，免疫组化实验也发挥着重要的作用。
例如，通过检测心肌标志物的表达情况，可以帮助医生判断心肌梗死的程度和范围。
实验十一小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察『目的要求』1
捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持 其尾巴向后拉，小鼠那么会尽力向前蹬。 用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤， 然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
腹腔注射
给药方法：
小白鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静 脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们 常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如 前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用 酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下， 进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹 腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿 左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的 液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。
『实验原理』 高等动物体内存在着具有防疫功能的吞
噬细胞系统，它由粒细胞和单核细胞等白细 胞构成，是机体免疫系统的重要组成局部。 巨噬细胞是体内的一种重要的免疫细胞，具 有非特异性吞噬功能，当机体受到细菌等病 原体及其它异物侵入时，巨噬细胞将向病原 体或异物游走，当接触异物时，伸出伪足将 其包围并进行内吞作用，将病原体或异物吞 入细胞，形成吞噬泡，进而初级溶酶体与吞 噬泡发生融合，将异物消化分解掉。本实验 将观察到小鼠巨噬细胞对进入其体内的鸡血 红细胞进行吞噬的情况。
单核巨噬细胞
『实验内容和方法』 (一)标本制备 1、在实验前一天，每只小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤(含4％
的台盼蓝)lml。 2、实验时每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％的
鸡红细胞悬液lml。然后轻揉小鼠腹部，使鸡红细胞分 散。(腹腔注射时不要刺伤内脏) 3、20分钟后向腹腔注射0.5 ml生理盐水，轻揉小鼠腹部， 使其腹腔液稀释。3分钟后用用颈椎脱臼法处死小鼠。 4、将小鼠置于解剖盘中或卫生纸上，剪开腹腔，把内脏 推向一侧，用吸管或不装针头的注射器吸取腹腔液。 5、每人取一干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片， 标本便制备好了。 6、实验绘图。
免疫组化实验原理
Ig的基本结构与性质
• 每条Ig单体皆有2条相同的重链和2条相同
的轻链构成，链间以二硫键连接。在多肽 链的N端因氨基酸序列不同而有2个可变区， 它们是结构相同的2个Fab片段，因此一个 Ab单体分子有2个Ag结合部位（双价）；在 C端氨基酸序列稳定为恒定区，即Fc片段， 是第二抗体的结合部位或受体结合部位。
• 在做免疫组化及染色之前，一般先做
常规HE染色，以评估组织切片的质量
及组织细胞的成分，避免因切片问题
引起免疫组化的阴性结果。
免疫组化技术的应用
• 确定细胞类型 • 辨认细胞产物 • 了解分化程度 • 鉴定病变性质 • 发现微小转移灶 • 探讨肿瘤起源或分化表型 • 确定肿瘤分期 • 指导预后和治疗 • 辅助疾病诊断和分类 • 寻找感染病因
组织抗原 抗体
标记物
1 荧光 2酶 3 亲和技术 4 金标
标记抗体
免疫组化反应原理
＋ 组织抗原
标记抗体
标记的抗原抗体复合物
抗原（Antigen）
• 概念：进入机体后刺激机体免疫系统产生抗体,并
能和相应的抗体发生特异性结合的物质。
蛋白质,多肽,酶,激素,细菌多糖,类脂质等
• 特性： • 免疫原性—引起机体产生抗体或致敏淋巴细胞 • 反应原性—与相应的抗产生的，只针对一 个抗原决定族，故所有抗体在分子结构上是完全一 样的，因此是最纯的抗体。
• 优点：高度稳定性，高度特异性 • 缺点：成本较高，敏感性较PcAb稍低
两种免疫组化反应方法
直接法
二抗
PcAb
一抗
McAb
间接法
间接法
• 先将组织或细胞中的某些化学物质提取出
缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济） 应用：基本不用！
实验小鼠针灸实验报告
一、实验背景针灸作为一种传统的中医疗法，在治疗多种疾病方面具有显著疗效。
近年来，随着科学研究的深入，针灸在实验动物模型中的应用逐渐受到关注。
本实验旨在探讨针灸对实验小鼠的免疫调节作用，以期为临床应用提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验动物：选取健康昆明种小鼠32只，体重（20±2）g，随机分为空白对照组、模型组、针灸组。
2. 实验仪器：电针治疗仪、电子显微镜、酶标仪等。
3. 实验方法：（1）建立模型：采用环磷酰胺（CTX）诱导小鼠免疫抑制模型。
（2）针灸治疗：对针灸组小鼠进行电针治疗，选取“足三里”、“肾俞”、“肺俞”等穴位，每次治疗30分钟，每日1次，连续治疗7天。
（3）免疫指标检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平。
（4）细胞因子检测：采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值。
（5）组织学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法观察小鼠脾脏组织形态学变化。
三、实验结果1. 免疫指标：与空白对照组相比，模型组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）。
2. 细胞因子：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著升高（P<0.05）。
3. 组织学观察：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏组织出现淋巴细胞减少、组织结构紊乱等病理变化；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏组织病理变化明显减轻。
四、讨论本实验结果表明，针灸可以显著提高实验小鼠的免疫功能，其作用机制可能与以下方面有关：1. 调节细胞因子水平：针灸可上调小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平，这些细胞因子在免疫调节中发挥重要作用，可增强机体免疫功能。
小鼠t细胞表面标志__概述说明以及解释_
小鼠t细胞表面标志概述说明以及解释1. 引言1.1 概述T细胞是免疫系统中非常重要的一种淋巴细胞，能够对抗感染和诱发免疫反应。
T细胞在机体免疫应答的调节和控制中起到了关键作用。
小鼠作为实验动物模型，在研究免疫系统功能和相关疾病机制方面具有广泛应用价值。
在T细胞表面，有很多特定的蛋白质或分子被称为表面标志，它们可以在免疫系统中识别和区分不同类型的T细胞，并参与调控T细胞的活化、增殖、分化等过程。
因此，了解小鼠T细胞表面标志的表达及其功能对于深入理解小鼠免疫系统和相关疾病具有重要意义。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面来介绍小鼠T细胞表面标志：首先，介绍T细胞的基本概念，包括其分类、结构以及功能；其次，阐述小鼠T细胞表面标志的重要性和作用机制；然后，列举一些常见的小鼠T细胞表面标志及其功能进行详细讨论；接着，介绍了表达小鼠T细胞表面标志的方法和技术，包括流式细胞术（流式细胞仪）、免疫组化染色法以及免疫荧光染色法；最后，总结了小鼠T细胞表面标志与免疫系统相关疾病的关联性研究进展，并提出了未来的研究展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍小鼠T细胞表面标志及其功能，并探讨这些标志与免疫系统相关疾病之间的关系。
通过对小鼠T细胞表面标志的深入了解，有助于加深我们对小鼠免疫系统的理解，并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。
2. 小鼠T细胞表面标志2.1 T细胞基本概念T细胞是一类免疫系统中的重要细胞，主要负责调节和协调机体的免疫反应。
作为一种特殊类型的白血球，T细胞可以通过其表面上不同的标志物来实现对宿主免疫系统的调控。
小鼠作为实验动物之一，其T细胞表面标志在免疫学领域中受到广泛关注。
2.2 T细胞表面标志的重要性小鼠T细胞表面标志具有重要的生物学功能和临床意义。
这些标志物能够帮助我们认识和分辨不同类型和亚群的T细胞，并对其功能进行描述和区分。
通过研究T细胞表面标志，我们可以深入了解小鼠免疫系统中T细胞的分布、数量、活性状态以及与其他免疫组分之间的相互作用，从而推动疾病机制和治疗方法等方面的研究进展。
细胞分离实验
视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。
研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。
研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。
实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。
脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。
研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。
实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。
实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。
2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。
3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。
单次大剂量、多次小剂量环磷酰胺腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型对比观察
单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型对比观察李燕华ꎬ梁月琴ꎬ夏洪颖ꎬ王崇静ꎬ李仲昆昆明市延安医院ꎬ昆明６５００５１㊀㊀摘要:目的㊀对比观察单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺(ＣＹ)腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型的效果ꎮ方法㊀３０只ＩＣＲ健康雄性小鼠随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎬ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ比较各组小鼠体质量㊁脾脏指数㊁胸腺指数㊁ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量ꎮ结果㊀与空白组比较ꎬ单词组实验第８ｄ及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬ单词组和多次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单词组ＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论㊀单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对小鼠体质量影响更小ꎬ且造模效果佳ꎮ㊀㊀关键词:环磷酰胺ꎻ动物模型ꎻ免疫抑制模型㊀㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.０３.０１１㊀㊀中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)０３￣００４２￣０５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅａｂｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｏｌｅｌｓＬＩＹａｎｈｕａꎬＬＩＡＮＧＹｕｅｑｉｎｇꎬＸＩＡＨｏｎｇｙｉｎｇꎬＷＡＮＧＣｏｎｇｊｉｎｇꎬＬＩＺｈｏｎｇｋｕｎＹａｎᶄａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＣｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５００５１ꎬＣｈｉｎａ基金项目:昆明市卫生科技人才培养项目(２０１６ＳＷＲＣ)ꎮ通信作者:李仲昆(Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｙｙｌｚｋ＠１６３.ｃｏｍ)[１１]ＶｉｔｏｒａｔｏｕＤＩꎬＴｏｌｉａＭꎬＬｉａｋｏｓＰꎬｅｔａｌ.Ｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｃｅｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅＦａｃｔｏｒ￣１αꎬｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ￣１ａｎｄｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸｉｎｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒａｆｔｅｒｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅｃｈｅｍｏｒａ￣ｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].ＪＢｕｏｎꎬ２０１９ꎬ２４(２):４５６￣４６３.[１２]熊艳峰ꎬ赖晓红ꎬ梁桦ꎬ等.七氟醚对单肺通气大鼠肺癌ＨＩＦ１α/ＥＭＴ通路活性及侵袭力的影响[Ｊ].实用医学杂志ꎬ２０１８ꎬ３４(１２):１９７０￣１９７２.[１３]ＬｉＹＸꎬＤｉｎｇＳＪꎬＸｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｄｅｓｆｅｒｏｘａｍｉｎｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａａｎｄｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ[Ｊ].ＮｅｕｒｏｓｃｉＢｕｌｌꎬ２００８ꎬ２４(２):８９￣９５.[１４]ＣｈｅｎＹꎬＦａｎＺꎬＬｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｙｐｅｒｂａｒｉｃｏｘｙｇｅｎｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｏｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｓｃｈｅ￣ｍｉａ￣ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＣｏｌｌＰｈｙｓｉｃｉａｎｓＳｕｒｇＰａｋꎬ２０１９ꎬ２９(１０):１０１６￣１０１７.[１５]蒋智永ꎬ胡子健ꎬ孟承颖ꎬ等.ＨＩＦ￣１α对大鼠内皮细胞通透性的影响及作用机制[Ｊ].安徽医科大学学报ꎬ２０１９ꎬ５４(７):１６０１￣１０６５.[１６]ＺｈｏｕＹꎬＦａｔｈａｌｉＮꎬＬｅｋｉｃＴꎬｅｔａｌ.Ｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｎｅｏｎａｔａｌｈｙｐｏｘｉｃ￣ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｐｕｐｓｂｙｔｈｅｏｐｉｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ/Ａｋｔｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].Ｓｔｒｏｋｅꎬ２０１１ꎬ４２(２):４３９￣４４４.[１７]孙志超.胃癌中ＨＩＦ￣１α㊁ＶＥＧＦ和ＥＧＦＲ的表达及临床病理意义[Ｊ].齐齐哈尔医学院学报ꎬ２０１８ꎬ３９(２４):２８５６￣２８５９. [１８]ＫｉｔａｕｒａＪꎬＭｕｋａｉＳꎬＭｏｒｉｍｏｔｏＨꎬｅｔａｌ.Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌｈｅｍａｔｏｍａａｆ￣ｔｅｒｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｉｎａｐａ￣ｔｉｅｎｔｗｉｔｈａｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｏｔａｌａｏｒｔｉｃａｒｃｈｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＫｙｏｂｕＧｅ￣ｋａꎬ２０１９ꎬ７２(９):６７３￣６７６.[１９]ＬｉｕＢＮꎬＨａｎＢＸꎬＬｉｕＦ.ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＡｋｔａｎｄＨＩＦ￣１αｏｎｉｓｃｈｅｍｉａｒａｔｓ[Ｊ].ＡｓｉａｎＰａｃＪＴｒｏｐＭｅｄꎬ２０１４ꎬ７(３):２２１￣２２５.[２０]ＣｈｅｎｇＺꎬＬｉＬꎬＭｏＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｉｎｖａｓｉｖｅｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓｒａｔｓａｇａｉｎｓｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｂｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳＴＡＴ３ａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＭｏｌＭｅｄꎬ２０１４ꎬ３４(４):９５７￣９６６.(收稿日期:２０１９￣１０￣１４)２４㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ(ＣＹ)ａｂ￣ｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｉｒｔｙｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＩＣＲｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ１００ｍｇ/ｋｇｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙꎬｔｈｅｍｉｃｅｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)ｏｎｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅｏｎｔｈｅｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓ.ＴｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔꎬｖｉｓｃｅｒａｌｉｎｄｅｘꎬｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘꎬＰＰｓｃｏｕｎｔꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ８ｔｈｄａｙａｎｄｉｎｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ３ｒｄꎬ５ｔｈꎬ７ｔｈａｎｄ８ｔｈｄａｙｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５)ꎻｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉ￣ｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎ￣ｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＢｏｔｈｔｈｅｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｓｏｆＣＹｃａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｆｏｒｍｅｒｈａｓｌｅｓｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔａｎｄｂｅｔｔｅｒｍｏｄｅｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅꎻａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓꎻｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌｓ㊀㊀免疫器官㊁免疫细胞和免疫分子共同组成了免疫系统ꎬ是对抗感染和肿瘤至关重要的因素[１]ꎮ近年来ꎬ由环境污染㊁生态失衡等所引发的免疫抑制性疾病的发病率逐年上升ꎬ而建立适合的免疫抑制模型对进一步研究该类疾病尤为重要[２]ꎮ环磷酰胺(ＣＹ)是一种抗肿瘤药物ꎬ其也具有显著的免疫抑制作用[３]ꎬ是治疗免疫疾病的常用药物ꎬ特别在作为联合应用的免疫调节剂和抗肿瘤药物方面已广泛应用[４ꎬ５]ꎮＣＹ在抑制癌细胞增殖的同时ꎬ也抑制免疫细胞的增殖ꎬ可造成机体免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)的全面抑制ꎮ因此ꎬ许多国家和国际机构均推荐ＣＹ作为免疫毒性的阳性物[６~８]ꎮ采用ＣＹ建立免疫抑制模型的方法常采用单次大剂量(１００㊁１５０ｍｇ/ｋｇ)和多次小剂量[２０㊁４０㊁８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]两种给药方法ꎬ但是较大剂量[８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]腹腔连续注射３ｄ后可造成实验后期动物的死亡[９]ꎮ为减少实验动物的病死率ꎬ提高造模的成功率ꎬ为免疫抑制实验模型的建立提供参考ꎬ本研究采用单次大剂量注射和小剂量多次注射的给药方法制备小鼠免疫抑制模型ꎬ并对小鼠的体质量及末次注射ＣＹ后２４ｈ的脏器指数㊁肠道黏膜派氏结(ＰＰｓ)计数㊁肠道黏膜ＰＰｓ淋巴细胞表型㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量等免疫指标进行比较ꎬ旨在为选择ＣＹ制备免疫抑制模型时的合适剂量提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＩＣＲ雄性小鼠３０只ꎬ６~８周龄ꎬ体质量(２０ʃ２)ｇꎬ购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司ꎬ动物许可证号ＳＣＸＫ(湘)２０１１￣０００３ꎮ１.２㊀药物㊁试剂及仪器㊀０.９％氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司ꎬ生产批号ａｄ１６０２０１ｂ２)ꎻ注射用ＣＹ(江苏盛迪医药有限公司生ꎬ批号１７１０２５２５)ꎻＤＡＢ试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)ꎮ抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁抗小鼠ＣＤ１９￣ＰＥ㊁ＣＤ６９￣ＰＥ￣ＣＹＴＭ７(美国ＢＤ￣Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司ꎬ批号分别为５５３０６２㊁５５７３９９㊁５５２８７９)ꎻＡｎｔｉ￣ＴＬＲ４ａｎｔｉｂｏｄｙ试剂盒(Ａｂｃａｍ公司ꎬ批号ＧＲ３２５０３４￣５)ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)(法国Ｂｉｏｗｅｓｔ公司ꎬ批号０２０４１３￣ＵＹ)ꎻ改良型ＲＰＭＩ１６４０培养基[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司ꎬ批号ＮＡＣ１３６１]ꎮＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪(ＦＣ￣５００)(美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司)ꎻ全自动酶标仪Ｍｏｄｅｌ５５０(美国ＢＩＯ￣ＲＡＤ公司)ꎻＬＥＧＥＮＤＭＩＣＲＯ１７台式微量离心机(美国Ｔｈｅｒｍｏ公司)ꎻ倒置相差显微镜(ＢＤＳ２００)(重庆奥特光学仪器有限责任公司)ꎻＴＤ５Ｍ低速多管架自动平衡离心机(长沙万佳森仪器设备有限责任公司)ꎻ光学显微镜(Ｎｉｋｏｎ５０ｉ):日本Ｎｉｋｏｎ公司ꎻＦＡ２００４电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)ꎻ血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)ꎻＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ(１００μｍꎬ７０μｍ)(美国Ｆａｌ￣ｃｏｎ公司)ꎻ眼科剪㊁眼科镊ꎮ１.３㊀实验动物分组及免疫抑制模型制备㊀将ＩＣＲ健康雄性小鼠适应性暂养１周后ꎬ称重㊁标记ꎬ后随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎮ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ以免疫抑制模型ꎻ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ各注射后自由取食饮水ꎮ３４１.４㊀小鼠体质量测定㊀采用电子秤测定实验第１㊁３㊁５㊁７㊁８ｄ每只小鼠的体质量ꎬ并记录ꎮ１.５㊀小鼠处死及相关指标测定㊀实验第８ｄꎬ以颈椎脱臼法处死小鼠３０只ꎬ按下列步骤测定小鼠脏器指数㊁肠黏膜ＰＰｓ计数㊁肠黏膜ＣＤ３＋㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊁小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡꎮ１.５.１㊀小鼠脏器指数测定㊀沿胸部和腹部中线切开小鼠ꎬ按解剖位置摘取脾脏和胸腺ꎬ小心剔除其周围的筋膜及组织ꎬ滤纸吸干残余的血液后进行称重(ｇ)ꎬ将称得的重量(ｇ)除以小鼠体质量(ｇ)ꎬ计算胸腺指数和脾脏指数ꎬ脾脏指数(％)＝脾脏重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎬ胸腺指数(％)＝胸腺重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎮ１.５.２㊀小鼠肠黏膜ＰＰｓ计数㊀打开小鼠腹腔ꎬ取出全段小肠ꎬ迅速放入含有５％胎牛血清(５％ＦＢＳ)的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ剔除肠系膜及肠黏膜表面的脂肪组织ꎬ在外肠壁上可看见麦粒样的圆形突起ꎬ即为ＰＰｓ[１０]ꎬ肉眼计数并记录ＰＰｓ数目ꎮ１.５.３㊀小鼠肠黏膜ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊀ＰＰｓ淋巴细胞获取及表型测定肉眼计数并记录ＰＰｓ数目完成后ꎬ将小鼠肠腔冲洗干净ꎬ迅速放入含５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎻ用眼科镊和眼科剪小心分离出ＰＰｓꎻ将其浸入含５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ先用５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液浸润１２０目细胞筛ꎬ并将ＰＰｓ小心移入细胞筛中ꎬ用研磨棒以适当的力度轻轻研磨ꎬ再用５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液冲洗细胞筛过滤ꎻ以上滤液用２００目细胞筛过滤ꎻ收集滤液ꎬ加至５ｍＬꎬ以２０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ加入５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液约３ｍＬꎬ重悬细胞即得ＰＰｓ细胞悬液ꎮ将收集到的ＰＰｓ细胞计数并调节细胞浓度至１ˑ１０７/ｍＬꎬ分别取１００μＬ细胞加入流式检查专用试管中进行荧光标记ꎬ每管依次加入抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁ＣＤ１９￣ＰＥ单克隆抗体各０.５μｇꎬ混匀后４ħ避光孵育３０ｍｉｎꎬ用ＰＢＳ洗涤细胞两次(１５００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎬ弃上清ꎬ用ＰＢＳ３００μＬ重悬后进行流式细胞仪检测[１０]ꎮ１.５.４㊀小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡ测定㊀取出全段小肠ꎬ用带有灌胃针的１０ｍＬ注射器向肠腔内注入ＮＳ约３ｍＬꎬ并在小肠内保留３ｍｉｎꎬ轻轻晃动使肠腔内的内容物充分溶解ꎬ将肠腔内灌洗液收集于ＥＰ管中ꎬ以３０００ｒ/ｍｉｎ的速度离心１０ｍｉｎꎬ收集上清液于冻存管ꎬ－８０ħ储存ꎬ编号备用ꎮ待样本收齐后ꎬ严格按酶联免疫技术(ＥＬＩＳＡ)鼠ＳＩｇＡ试剂盒说明书操作[１０]ꎬ即取１００μＬ不同浓度梯度的标准品㊁样品㊁阳性对照品和空白分别加入酶标板ꎬ３７ħ孵育２ｈꎻ用拍板纸拍干板子ꎬ不洗板ꎻ提前２０ｍｉｎ配制Ｄｅｔｅｃ￣ｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ孵育６０ｍｉｎꎻ洗板３次ꎻ每个孔加３００μＬ１ˑ洗液工作液放置２ｍｉｎ后用拍板纸拍干板子ꎻ提前２０ｍｉｎ配制ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育３０ｍｉｎꎻ洗板５次ꎻ加入９０ｌ显色底物(ＴＭＢ)到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育１５ｍｉｎꎻ加入５０μＬ终止液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ用酶标仪在４５０ｎｍ处检测标准品和样本ＯＤ值ꎻ以ＯＤ值为纵坐标ꎬ以标准品浓度为横坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ根据ＯＤ值在标准曲线上查出浓度ꎮ１.６㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ２３.０统计软件ꎮ计量资料以 ｘʃｓ表示ꎬ组间比较采用单因素方差分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同时点各组小鼠体质量比较㊀不同时点小鼠体质量比较见表１ꎮ表１㊀不同时点各组小鼠体质量比较(ｇꎬ ｘʃｓ)细胞体质量实验第１ｄ实验第３ｄ实验第５ｄ实验第７ｄ实验第８ｄ单次组２１.４２ʃ０.２８２２.８３ʃ０.２８ｂ２４.０９ʃ０.３２ｂ２５.４４ʃ０.３７ｂ２５.１３ʃ０.３８ａｂ多次组２１.３３ʃ０.３０２２.３６ʃ０.２７ａ２３.４０ʃ０.３４ａ２４.４２ʃ０.２４ａ２４.８２ʃ０.２３ａ空白组２１.４６ʃ０.３３２２.９２ʃ０.３２２４.０７ʃ０.６４２５.２３ʃ０.４９２５.７５ʃ０.１９㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ２.２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较㊀脾脏指数㊁胸腺指数比较见表２ꎮ２.３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较㊀肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较见表３ꎮ表２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较(％ꎬ ｘʃｓ)组别脾脏指数胸腺指数单次组０.２７ʃ０.０２ａｂ０.０７ʃ０.０１ａｂ多次组０.３６ʃ０.０２ａ０.１１ʃ０.０４ａ空白组０.４６ʃ０.０３０.１７ʃ０.０５㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ４４表３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较( ｘʃｓ)组别ＰＰｓ计数(个)ＣＤ３＋细胞比例(％)ＣＤ１９＋细胞比例(％)肠道黏膜ＳＩｇＡ含量(μｇ/ｍＬ)单次组４.７０ʃ０.４８ａｂ５５.３７ʃ４.９５ａｂ４５.１１ʃ５.３６ａｂ２２.７３ʃ３.２７ａｂ多次组５.９０ʃ０.７４ａ４８.８５ʃ２.６８ａ５１.１６ʃ４.８１ａ３２.４７ʃ３.２９ａ空白组７.３０ʃ０.８２３８.６９ʃ４.１７６１.４０ʃ５.１５４０.８６ʃ２.９４㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ３㊀讨论㊀㊀免疫系统的各种细胞㊁组织和器官的组成成分和功能的正常是机体免疫功能的基本保证ꎬ任何一方面的缺陷都将导致免疫功能障碍ꎮ机体自发㊁病原或药物㊁营养因素㊁环境因素均可引起免疫系统的功能异常ꎬ进而导致功能障碍㊁免疫应答和保护功能的降低或消失ꎬ最后引发机体丧失抵抗感染能力或形成免疫性疾病ꎬ容易受到细菌㊁病毒㊁真菌等感染ꎬ甚至容易长肿瘤[１１~１３]ꎮ目前ꎬ对免疫抑制性疾病的治疗主要以调整机体的自身免疫功能为主ꎬ免疫增强剂在医学上的应用已经引起了人们的广泛关注[１４]ꎮ中药免疫增强剂是目前使用较多的免疫增强剂ꎬ它可激活免疫活性细胞ꎬ增强机体的免疫功能ꎻ还可作为辅助药物与一些疫苗合用ꎬ增强免疫应答ꎬ提高免疫效应ꎻ主要用于一些免疫功能缺陷及难治性感染ꎮ但其仅在动物饲料添加中使用较为广泛ꎻ在临床使用方面ꎬ受到一定的限制ꎬ需要进入深入的研究开发[１５]ꎮ为此ꎬ建造安全有效的免疫抑制动物模型显得尤为重要ꎮ在生命科学研究中ꎬ免疫抑制动物模型建造的主要方法包括去胸腺动物模型㊁基因敲除动物模型㊁辐射损伤模型和免疫抑制剂模型等[１６~１８]ꎬ其中使用免疫抑制剂进行建模的方法由于总体成本较低㊁操作简便并且重复性好ꎬ因此在目前的研究中广泛应用ꎮ用于建立免疫抑制动物模型的免疫抑制剂包括微生物酵解产物类㊁激素类㊁抗代谢物类㊁抗体类㊁烷化剂类等ꎬ其中烷化剂类免疫抑制剂是建立的免疫抑制模型研究中最常用的方法ꎮ烷化剂按化学结构可分为氮芥类㊁磺酸酯及多元醇类㊁亚硝基脲类㊁三氮烯咪唑类和胼类㊁乙撑亚胺类ꎮ㊀㊀ＣＹ是一种抗肿瘤药物ꎬ对白血病和实体瘤都有效ꎬ是第一个所谓 潜伏化 广谱抗肿瘤药ꎮＣＹ是一种无活性的前药ꎬ在氮芥部分上连有一个吸电子的环状磷酰基ꎬ降低了烷基化的能力ꎬ体外几乎无活性ꎬ当其进入人体后ꎬ被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解ꎬ变为活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥类衍生物ꎮ磷酰胺氮芥作为烷化剂的一种在体内能和细胞的蛋白质和核酸相结合ꎬ使蛋白质和核酸失去正常的生理活性ꎬ发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用ꎬ同时由于其非特异性ꎬ也会产生针对骨髓㊁胃肠道上皮和生殖系统等生长旺盛的细胞毒性ꎻ此外ꎬ还对免疫器官和敏感的淋巴细胞产生影响ꎬ进而对免疫功能产生明显抑制ꎮ可用于乳腺癌㊁恶性淋巴瘤ꎬ多发性骨髓瘤㊁白血病㊁卵巢癌㊁宫颈癌㊁前列腺癌㊁结肠癌㊁支气管癌㊁肺癌等肿瘤的化疗ꎻ还可作为免疫抑制剂用于各种自身免疫性疾病ꎬ如天疱疮以及溃疡性结肠炎㊁严重类风湿性关节炎㊁全身性红斑狼疮㊁多发性肉芽肿㊁特发性血小板减少性紫癜㊁儿童肾病综合征等ꎬ以及用于器官移植时抗排斥反应[１９~２３]ꎮＣＹ因其效果稳定㊁较易获得同时成本不高ꎬ常用于建立免疫抑制模型并有较多的文献报道ꎬ因而被广泛接受并应用于药物药效学评价和安全性评价ꎮ㊀㊀文献[６]报道ꎬ实验动物腹腔注射ＣＹ后ꎬ可导致动物体质量不同程度的降低ꎬ这与使用ＣＹ的剂量和时间有关ꎬ尤其是在注射后的第１周ꎬ但大剂量单次注射体质量明显高于小剂量连续注射组ꎮ与空白组比较ꎬ单词组实验第８天及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量降低ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量升高ꎮ脾脏是机体最大的外周免疫器官ꎬ当抗原刺激机体后ꎬ免疫细胞(Ｔ细胞㊁Ｂ细胞和巨噬细胞)过度增生ꎬ导致其体积增大ꎻ胸腺是机体的中枢免疫器官ꎬ是Ｔ细胞分化成熟的场所ꎻ而机体免疫抑制时ꎬ使得淋巴组织萎缩ꎬ免疫器官的体积缩小ꎮ故免疫器官的脏器指数体现了其发育情况ꎬ可间接的反映机体的免疫状态ꎮ本研究显示ꎬ单次组和多次组均出现了脾脏指数和胸腺指数的降低ꎬ且单次组较多次组明显ꎬ间接说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ且单次组较多次组明显ꎮＰＰｓ是沿着小肠纵向分布位于膜系膜固有层和黏膜下层的微小淋巴样组织ꎬ含有胸腺源性Ｔ细胞和Ｂ细胞ꎬ其中心区域富含Ｂ细胞ꎬ是诱导肠道黏膜进行免疫应答的重要部位ꎬＰＰｓ淋巴细胞数量和活性状态等可以反映肠道黏膜局部的免疫功能状态ꎮＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞代表总的Ｔ淋巴细胞ꎬ而ＣＤ１９＋是Ｂ淋巴细胞表面抗原ꎬ除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系所有发育阶段都有ＣＤ１９分布ꎬＣＤ１９也是ＣＤ１９/ＣＤ２１/ＣＤ８１信号复合物的重要组成部分ꎬ故ＣＤ１９＋代表了ＰＰｓ内除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系不同发育阶段Ｂ细胞的总和ꎮ在既往的研究中ꎬ不同的ＣＹ造模实验５４均可导致Ｔ淋巴细胞㊁Ｔｈ细胞㊁Ｔｓ细胞比例升高ꎬＢ淋巴细胞比例下降[６]ꎮ本文发现ꎬ单次组和多次组均出现了ＣＤ３＋细胞比例升高ꎬＣＤ１９＋细胞比例降低ꎬ且单次组较多次组更为明显ꎬ进一步说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ造模成功且单次组效果更佳ꎮ有研究[９ꎬ２４]表明ꎬ大剂量ＣＹ(１００ｍｇ/ｋｇ)制造免疫抑制模型效果更佳ꎻ在连续腹腔注射ＣＹ的动物模型中ꎬ４０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)和６０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的用量均可完成免疫抑制模型的成功造模[２５]ꎬ但后者的效果优于前者ꎮ康慧琳等[２６]发现ꎬ高剂量ＣＹ通过抑制ＤＮＡ的复制㊁促进细胞凋亡ꎬ降低免疫细胞功能ꎬ使机体处于免疫抑制状态ꎮ免疫效应分子ＳＩｇＡ由肠道黏膜固有层浆细胞分泌ꎬ是机体内分泌量最大的免疫球蛋白ꎬ也是肠黏膜表面主要的免疫球蛋白ꎬ对消化道黏膜起着重要防御作用ꎬ当ＣＹ免疫引起抑制时ꎬ可引起肠道粘膜ＳＩｇＡ水平下降[２７]ꎮ本研究中ꎬ肠道粘膜ＳＩｇＡ的含量也出现了相同的变化趋势ꎬ且以单次组更为明显ꎮ㊀㊀总之ꎬ单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对体质量影响更小㊁造模效果更佳ꎮ参考文献:[１]ＬｉｎｄｓａｙＢ.Ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＥｓｓａｙｓＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１６ꎬ６０(３):２７５￣３０１.[２]钟金凤ꎬ方热军.环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[Ｊ].中国免疫学杂志ꎬ２０１６ꎬ３２(１０):１５４１￣１５４５. 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[８]ＨｕｙａｎＸＨꎬＬｉｎＹＰꎬＧａｏＴꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅｏｎｗｈｉｔｅｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓａｎｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｐｏｐｕｌａ￣ｔｉｏｎｓｆｒｏｍｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆＢａｌｂ/ｃｍｉｃｅ[Ｊ].ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐ￣ｈａｒｍａｃｏｌꎬ２０１１ꎬ１１(９):１２９３￣１２９７.[９]张俊ꎬＹｏｎｇ￣ＳｅｏｎｇＳｈｉｎꎬ胡安君ꎬ等.环磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢进模型的建立与评价[Ｊ].中国实验动物学报ꎬ２０１５ꎬ２３(４):３９５￣４００.[１０]李燕华ꎬ梁月琴ꎬ王崇静ꎬ等.粗根荨麻多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠肠道派氏结细胞表型及ＴＬＲ４的影响[Ｊ].中成药ꎬ２０１７ꎬ３６(６):１２７２￣１２７６.[１１]马肖静ꎬ周慧婷ꎬ董熠ꎬ等.肿瘤发生与免疫逃逸相关机制的研究进展[Ｊ].肿瘤学杂志ꎬ２０１８ꎬ２４(１１):１０４６￣１０５０.[１２]何亚运ꎬ罗泊涛ꎬ陆元志.肿瘤微环境中免疫抑制性细胞和细胞因子在抗肿瘤免疫反应中的作用研究进展[Ｊ].山东医药ꎬ２０１９ꎬ５９(６):８８￣９２.[１３]杜娜雯ꎬ白日兰ꎬ崔久嵬.肿瘤免疫逃逸机制及治疗策略[Ｊ].中国肿瘤生物治疗杂志ꎬ２０１９ꎬ２６(４):４５４￣４６２.[１４]樊淑华ꎬ葛红莲.免疫增强剂的种类和应用[Ｊ].周口师范学院学报ꎬ２００９ꎬ２６(２):１０２￣１０６.[１５]晏继红ꎬ王仕宝ꎬ刘文虎.中药免疫增强剂研究进展[Ｊ].西北药学杂志ꎬ２０１３ꎬ２８(５):５４９￣５５２.[１６]ＲａｊＳꎬＲｕｉｚＰꎬＲｕｓｃｏｎｉＰ.Ｅａｒｌｙｐｒｉｍａｒｙｇｒａｆｔｆａｉｌｕｒｅａｆｔｅｒａｐｅｄｉ￣ａｔｒｉｃｈｅａｒｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｎｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｒｅｓｃｕｅｗｉｔｈｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓꎬｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓꎬａｎｄａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ[Ｊ].ＡｎｎＰｅｄｉａｔｒＣａｒｄｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０(１):６９￣７１.[１７]陈敬宇ꎬ江艺ꎬ张小进.术前脾切除对肝移植治疗门脉高压症的影响[Ｊ].中华肝胆外科杂志ꎬ２０１４ꎬ２０(８):５７２￣５７６. 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#实验7 小鼠巨噬细胞吞噬现象的观察
五、实验结果
图1
鸡红细胞为淡黄色、椭圆形、有核的细胞。而数量较多、体积较大圆形或不 规则的细胞，其表面有许多似毛刺装的小突起（伪足），胞质中有数量不等 的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡）为巨噬细胞。
图2
图3
有的鸡红细胞(一至多个)紧贴巨噬细胞的表面 图4 图5
有的已将1至数个红细胞部分吞入
实验
十二
小鼠巨噬细胞吞噬现象的观察
College of Life Science and Technology, XINJI观察小鼠巨噬细胞吞噬红细胞的试 验，了解巨噬细胞对异物吞噬的原理和功 能。 2.了解巨噬细胞在机体非特异免疫中的重 要作用。
巨噬细胞吞入的红细胞在胞质中形成椭圆形的吞 噬泡
巨噬细胞内的吞噬泡与初级溶酶体发生融合，泡 内物正在被消化分解
五、实验结果
六．注意事项
1、给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤时要注意 进针适度，注射量要合适。 2、给小白鼠腹腔注射时，抓小鼠不要太 紧，以免小鼠死亡。 3、使用的载玻片要很干净。
七、实验作业
1．简述细胞吞噬作用的原理。 2．简述细胞吞噬作用的基本过程及其意义。
单核细胞（上）和巨噬细胞（下）
单核巨噬细胞吞噬过程示意图
巨噬细胞正在吞噬衰老的红细胞
巨噬细胞吞噬细菌（电镜）
肺巨噬细胞吞噬大肠杆菌（电镜）
三、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器、用具：显微镜、高压灭菌锅、解剖盘、解 剖剪、1ml注射器、吸管、载玻片、盖玻片。 2. 材料：小鼠（体重20g左右），鸡血。 3. 试剂： 4%台盼蓝染液：台盼蓝染粉 0.4克，加0.85%生 理盐水100ml。 6%淀粉肉汤（含0.3%台盼蓝）：牛肉膏 0.3克； 蛋白胨 1.0克；氯化钠0.5克；蒸馏水 100ml。加热后, 可加入6.0克可溶性淀粉，促使溶解，再煮沸灭菌， 置40C冰箱保存，用时水浴熔化，加入适量4%台盼 蓝染液混匀，使呈蓝色。
小鼠炎症指标
小鼠炎症指标炎症是机体对于外界刺激的一种非特异性反应，它是机体免疫系统的一部分，旨在保护机体免受损害。
而小鼠是炎症研究中常用的实验动物，通过观察和测量小鼠体内的炎症指标，可以了解炎症状态和炎症反应的程度。
1. 白细胞计数：白细胞是机体免疫系统中的重要成分，对于炎症反应起着关键作用。
通过观察小鼠体内白细胞的数量变化，可以初步判断炎症的严重程度。
白细胞计数的上升往往意味着炎症反应的加剧。
2. C反应蛋白（CRP）：CRP是一种急性期蛋白，它在炎症反应中起着重要的作用。
炎症引起的细胞损伤会导致CRP的合成和释放增加，因此测量小鼠体内的CRP水平可以间接反映炎症的程度。
3. 细胞因子：细胞因子是一类介导炎症反应的重要分子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-1（IL-1）。
测量小鼠体内这些细胞因子的水平可以直接反映炎症反应的程度和类型。
4. 体温变化：炎症反应往往伴随着局部组织的充血和渗出，导致体温升高。
通过测量小鼠体温的变化，可以初步了解炎症的程度和范围。
5. 组织病理学变化：炎症反应引起的组织病理学变化是炎症指标中最直接的体现。
通过对小鼠炎症部位进行组织病理学检查，可以观察到炎症细胞浸润、组织坏死和纤维化等变化，进一步了解炎症的程度和类型。
6. 活性氧和氧自由基：炎症反应可以导致活性氧和氧自由基的生成增加，从而导致细胞和组织的氧化损伤。
通过测量小鼠体内活性氧和氧自由基的水平，可以了解炎症引起的氧化应激的程度。
7. 炎症相关基因表达：炎症反应会导致多个炎症相关基因的表达水平发生变化，通过测量小鼠体内这些基因的表达水平，可以初步了解炎症反应的程度和类型。
8. 血液和尿液生化指标：炎症反应对机体的代谢和内分泌等方面产生影响，可以导致血液和尿液生化指标的改变。
通过测量小鼠体内这些指标的变化，可以了解炎症对机体其他系统的影响。
总结起来，小鼠炎症指标是炎症研究中的重要内容，通过对小鼠体内炎症指标的观察和测量，可以初步判断炎症反应的程度和类型，为炎症相关疾病的预防和治疗提供理论依据。
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小鼠免疫组织及免疫细胞的观察
【实验原理】
免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。
中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免
疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。
各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。
【试剂和器材】
小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛
【操作方法】
1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹
腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。
2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。
3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来
水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜
下观察染色脾细胞。
【结果观察】
小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察
【注意事项】
1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。
2.脾脏分离完整，清研轻柔。
3.染色时间不宜过长或过短。
.
【讨论】
脾脏具有多种重要的生理功能，参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转，绝非可有可无；脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色，有时甚至完全相反，即具有双向性、时向性的特点。
1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后OPSI的发生
率约为1 %〜2.4 %。
虽然OPSI的发生率不是很高，但脾脏
切除后，在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中，50 %患者
的病情迅速进展，并最终导致死亡。
脾脏为全身最大的淋巴
器官，血循环相当丰富，且脾脏具有延缓微循环的作用，有利于清除和吞噬多种抗原，减轻机体感染的发生。
同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子，如T细胞、B细胞、
K细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK细胞)、树突状细胞。
免疫因子包括tufstin因子、备解素即P 因子、纤维结合蛋白免疫核糖核酸环磷酸鸟苷内源性细胞毒因子、调理素和补体等。
而脾切除后，脾脏所产生的免疫因子及免疫细胞消失，血浆中免疫球蛋
白IgM、IgG下降，巨噬细胞活性下降，补体旁路活性下降及自身抗体活性增强，使免疫系统失衡，导致机体易感性增加，甚发生OPSI。
2.关于tufstin是主要由脾脏产生的促吞噬激素，N ajjar 于1970年首先发现。
是IgG分子Fc段的一种四肽(T hrLy s -P ro -A rg),通过激活中性粒细胞发挥吞噬功能。
需要在白细胞激肽酶及内羧基肽酶的共同作用下释放。
脾切除、
镰状红细胞贫血、特发性血小板减少性紫癜、 A IDS及一些
腹部疾病可使其水平下降，脾移植后可使tufstin的水平升高。
虽然已发现其在免疫系统中的重要作用，但具体机制仍
不十分明了。
理论上讲上述情况tufstin活性减低的原因包
括低Y球蛋白血症、脾脏内中性粒细胞释放减少、白细胞激
肽酶活性改变及tufstin分子异常。
3.脾脏的抗肿瘤功能机体发生肿瘤的主要原因为免疫系统
监控失调，而脾脏作为人体免疫系统的重要组成部分，无疑
与肿瘤的发生密切相关。
临床观察发现，脾脏不仅自身很少
发生原发恶性肿瘤且少有转移瘤出现，这也表明脾脏具有抗
肿瘤的作用。
目前大家较公认的观点为脾脏在肿瘤免疫中具有双向性、时向性的特点。
表现为在肿瘤早期脾脏具有抗肿瘤作用，而在晚期则表现为免疫抑制，促进肿瘤生长。
其抗肿瘤作用主要表现在：①可增强巨噬细胞的吞噬功能。
②可增强巨噬细胞溶解瘤细胞及其过氧化酶作用。
③通过增强
NK细胞活性发挥抗肿瘤作用。
④Chu认为，tufstin的抗肿
瘤机制不仅通过增加巨噬细胞的肿瘤趋向性、吞噬能力和分泌能力，更重要的是增加巨噬细胞产生氧自由基一超氧阴离子的能力，对杀伤肿瘤细胞具有重要意义。
关于脾脏边缘带
淋巴瘤的研究表明，肿瘤的发生也与脾脏免疫功能的下降有关。
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