用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型

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环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立

近阴性对照组。ＥＩＡ检测显示Ｃ０ｇｋ组血清抗体与ＬＳＰ１０ｍ／ｇ
ＣＯＴ５细胞株本人构建并保存于南华大学药物药理研究Ｈ —Ｍ
所。Ｍ７０Ｂ紫外分光光度仪为江苏泰州无线电仪器厂产品；５．
Ｃ：Ｏ培养箱为１Ｓｎｏ３本ａｙ公司产品；ＯＩＣＣ型倒置显微镜为重
的作用，建立一个免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体
（Ａ）ｍｂ的动物免疫模型。方法：雌性ＢＬ／小鼠经ＣＯ细ＡＢｃＨ胞免疫后分别给予不同剂量的ｃＰ诱导免疫耐受，选择血清抗体效价最低的一组小鼠按常规方式腹腔注射Ｃ —Ｍ５细ＨＯＴ胞进行免疫。ＥＩＡ测定各小鼠血清中ＣＯ抗体及ＣＯＬＳＨＨ —
性免疫抑制剂，可抑制各种动物的体液与细胞免疫
应答 ’ ，与抗原联用时能选择性杀伤针对外来抗原
于１ｉ、４ｈ４０ｍｎ２、８ｈ给小鼠腹腔注射不同剂量的免疫删减剂
药物Ｃ。２周后重复此过程，诱导小鼠对ＣＯ和ＣＯＴ５ＰＨＨ．Ｍ
１２２动物免疫．．
取生长良好的ＣＯ细胞以无菌ＰＳ洗涤ＨＢ
３遍，终以无菌ＰＳ悬浮，调整细胞密度至２×１Ｌ对８Ｂ０／，ＡＢｃ１０／，而后分别环磷酰胺（ｙｌ０ｐａｄ，Ｃ）一种非特异周龄的雌性ＢＬ／小鼠行腹腔注射（ ×１只）ｃｃ叩ｈｓｈｍｉｅＰ是

小鼠免疫功能检测建立小鼠免疫功能低下模型的研究

小鼠免疫功能检测建立小鼠免疫功能低下模型的研究小鼠免疫功能检测是评估小鼠免疫系统状态的重要手段之一、小鼠作为常用的动物模型，在研究免疫相关疾病、发展新药和疫苗等方面具有广泛应用。

建立小鼠免疫功能低下模型可以为进一步研究免疫功能的途径提供重要参考。

本文将介绍建立小鼠免疫功能低下模型的研究。

首先，建立小鼠免疫功能低下模型需要选择合适的免疫抑制方法。

常用的方法包括药物免疫抑制、单克隆抗体介导的免疫抑制和基因敲除等。

其中，药物免疫抑制是最常用的方法之一、糖皮质激素是目前最常用的免疫抑制药物之一，常用的剂量为每天20-40 mg/kg体重的甲泼尼龙。

免疫抑制剂如环孢素A和他克莫司也可以应用于建立免疫功能低下模型。

此外，通过单克隆抗体特异性抑制免疫应答也是另一种选择。

例如，通过注射CD4或CD8特异性单克隆抗体可抑制小鼠的T细胞功能。

此外，基因敲除技术也可以通过敲除免疫相关基因来建立小鼠免疫功能低下模型。

其次，建立免疫功能低下模型后需要对小鼠的免疫功能进行评估。

评估免疫功能的方法包括机体免疫指标的检测和特定病原体感染模型的建立。

机体免疫指标的检测可以通过检测外周血白细胞数目、淋巴细胞亚群的分布和功能等来评估小鼠的免疫功能。

此外，还可以通过ELISA、免疫荧光或流式细胞术等技术检测小鼠体内的免疫球蛋白水平和细胞因子水平等指标。

特定病原体感染模型的建立可以通过注射特定病原体来评估小鼠免疫功能。

例如，通过感染流感病毒来评估小鼠的免疫功能。

最后，通过研究免疫功能低下模型可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病的治疗和药物设计提供重要参考。

通过建立小鼠免疫功能低下模型，可以在影响免疫功能的基因和通路上进行深入研究，从而揭示免疫功能低下的机制。

此外，还可以利用这些模型开展新药和疫苗的研发，评估其免疫功能调节作用。

总之，小鼠免疫功能检测和建立免疫功能低下模型对于研究免疫系统的功能和调节机制具有重要意义。

通过评估小鼠免疫功能和建立免疫功能低下模型，可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病治疗和药物设计提供重要参考。

实验小鼠针灸实验报告

一、实验背景针灸作为一种传统的中医疗法，在治疗多种疾病方面具有显著疗效。

近年来，随着科学研究的深入，针灸在实验动物模型中的应用逐渐受到关注。

本实验旨在探讨针灸对实验小鼠的免疫调节作用，以期为临床应用提供理论依据。

二、实验材料与方法1. 实验动物：选取健康昆明种小鼠32只，体重（20±2）g，随机分为空白对照组、模型组、针灸组。

2. 实验仪器：电针治疗仪、电子显微镜、酶标仪等。

3. 实验方法：（1）建立模型：采用环磷酰胺（CTX）诱导小鼠免疫抑制模型。

（2）针灸治疗：对针灸组小鼠进行电针治疗，选取“足三里”、“肾俞”、“肺俞”等穴位，每次治疗30分钟，每日1次，连续治疗7天。

（3）免疫指标检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平。

（4）细胞因子检测：采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值。

（5）组织学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法观察小鼠脾脏组织形态学变化。

三、实验结果1. 免疫指标：与空白对照组相比，模型组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）。

2. 细胞因子：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著升高（P<0.05）。

3. 组织学观察：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏组织出现淋巴细胞减少、组织结构紊乱等病理变化；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏组织病理变化明显减轻。

四、讨论本实验结果表明，针灸可以显著提高实验小鼠的免疫功能，其作用机制可能与以下方面有关：1. 调节细胞因子水平：针灸可上调小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平，这些细胞因子在免疫调节中发挥重要作用，可增强机体免疫功能。

应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测

应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测摘要目的：应用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型并检测免疫抑制模型建立是否成功方法：十六只小鼠分为四大组，每组四只。

将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。

此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。

于第十五天对两组小鼠加强免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，即四组分别为NS-NS组、OVA-NS组、NS-CTX组、OVA-CTX组，免疫抑制模型建立。

用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验对天然免疫功能进行检测，淋巴细胞转化试验对细胞免疫功能进行检测，双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验对体液免疫功能进行检测。

结果：细胞免疫的检测（淋转实验）结果全为阴性，吞噬细胞功能的检测（吞噬实验）结果为阴性，体液免疫的检测（双扩实验和ELISA）结果有三项测定项目为阳性。

结论：虽然本实验不足以证明CTX对免疫功能的抑制作用，但从一些数据可以看出CTX的免疫抑制功能。

AbstractObjective:cyclophosphamide was applied to establish the mice immunos uppression model and detection whether the immunosuppression model s uccess or not.Meyhod:Divid the 16 mice into four groups, each group of four. Divid the four mice into two groups, control group and immunosuppressive gro ups. On the first day giver primary immune to the two groups of fou mic e, Control group mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immunosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (O H) 3 0.4 ml. In 8, 10, 12, 14 days inject 0.4 ml NS to the control group mice, inject 100 mg/kg CTX to the immunosuppressive mice. In the fift eenth day give strengthen immunity to the two groups of mice. Control g roup mice were injected NS 0.4 ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immu nosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4ml, which means the four groups were NS-NS group, OVA-NS grpoup, NS -CTX group, OVA-CTX group.,Immunosuppression model is established. Use macrophage cell in abdominal cavity of mice phagocytosis ink expe riment to test the natural immune function, The lymphocyte transformatio n test to test the cellular immune function, double immunodiffusion test, ELISA to test the humoral immune function.Result: The results cellular immune detection (lymphocyte transformation test) were all negative, the result Phagocytes function detection (Consuming experiment) was all negative, three of the results of humoral immunity test ( double immunodiffusion test and ELISA) are positive.Conclusion：Although this experiment is not enough to prove that CTX ‘s inhibitory effect on the immune function, but the CTX’s immunosuppressive function can be seen from some of the datas.关键词：免疫抑制环磷酰胺固有免疫体液免疫细胞免疫引言目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一,化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果,但均有不同程度的毒副作用,如化疗后往往会出现白细胞减少,特别是中性粒细胞减少,血小板减少等情况，严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷[1],随着肿瘤化疗的不断发展，肿瘤的治疗效果有了很大提高，但其免疫抑制的毒副作用却难以克服。

免疫抑制小鼠乳腺癌骨转移模型的构建和评价

ｍａｌｅｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ２ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｎｔｈｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｍｉｃｅ。ｊＩＪｉａｎＬＩＵＭｉｎ一
ＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹＥＣｈａｎｇ —ｓｈｅｎｇ．Ｅ —ｍａｉｌ：ｙｅｃｈｓｈ２００６＠１２６．ｃｏｍ
・
１８４・
广东医学
２０１４年１月第３５卷第２期
ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌＪａｎ．２０１４，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２

免疫抑制小鼠乳腺癌骨转移模型的构建和评价术
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｉｍｍｕｎ０ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｍｉｃｅｍｏｄｅｌｏｆｂｏｎｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓｆｒｏｍｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，

免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉病动物模型的建立

ｓｓｉ．Ｔｈｅｔｎｅｖｏｓｏｃｆｅｎｅｔｎｗｅｅｒｃｒｅ．Ａｌｃｒｌｅｔｄｆｅｅｔｔｍｅｐｉｔｎｄｅｄａｈａｄｂｈａｉｒｆｍｉｅａｔｒｉｆｃｉｒｅｏｄｄｏｌｍｉｅｗｅｅｋｉｄａｉｒｎｉｏｎｓａｌ
ｔｅｌｇｔｓｕｅｗａｎｌｚｄｈｓ叩ａｈｌｇｃｌ．Ｒｅｕｌｈｕｎｉｓｓａａｙｅｉｔｔｏｏｉａｌｙｓｔｓ
Ｔｅｎｕｏｈｌｃｕｔｉ（５ｈｅｔｐｉｏｎｓｎ１０＋１０ｍ／ｇＣＡｄｓｓｒｓ５）ｇｋＰｏｅ
ｍｉｅｗｈｃｕｌｅｕｅｎｐｅｌｎｃｌａｄｃｉａｅｅｒｈ．ＭｅｈｏＩｒｅｏｇｔｉｃｉｈｗｏｄｂｓｄｉｒｃｉｉａｎｌｎｌｒｓａｃｔｄｓｎｏｄｒｔｅｍｍｕｏｕｒｓｅｃ，ＩｎｓｐｐｅｓｄｍｉｅＣＲ
ＡｐｒｉｕｕｇｔＦ９ａｎｃｌｅｙｎｓｌｒｐｏａｈｍｕｅｔｇｎｒｔｖｓｅｐｌｎｒｓｅｉｏｓｅｌｓｆｍｉａｕＡ２３ｗｓｉｏｕａｄｂｏｔｏｆｅｃｏｓｏｅｅａｉａｉｕｍｏａａｐｒｌ — ｇｌｓｔｉｒｄｅｎｖｙｇｌ
ｍｃｅｅａｍｎｓｔｄｄｅｅｔｏｅｆｙ１ｈｓｈｍｄ（ＰｉｅｒｄｉｉｒｉｒｎｓｓｃｐｏｐａｉｅＣＡ）ｉｒｐｒｏｅｌ，ａｄｄｘｍｔａｏｅｓｄｍｐｏ— ｗｔｅｆｄｏｃｏｎａｅｉｎａｙｎｅａｅｓｎｏｉｈｓｔｔｌｈｕ

环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立

环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立高芃;钱嘉林;刘长喜;严卫星【期刊名称】《环境与职业医学》【年(卷),期】2004(21)4【摘要】[目的 ]建立肿瘤化疗免疫抑制动物模型 ,为建立保健食品减轻化疗毒副作用功能的评价方法提供科学依据。

[方法 ]给予C57BL/6J正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔内注射不同剂量的环磷酰胺 (CP) ,隔日连续腹腔注射 4～ 5次 ,观察对小鼠免疫学指标及肝肾功能的影响。

[结果 ]正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔注射 2 0、5 0、10 0mg/kg体重的CP后 ,各剂量组均出现不同程度的免疫抑制和肝肾功能损伤。

①正常小鼠 2 0mg/kg体重以上剂量组 ,白细胞计数、抗体生成细胞以及巨噬细胞功能显著下降 ,谷草转氨酶 (AST)升高 ;5 0mg/kg体重剂量组的脾脏指数下降 ;50mg/kg体重以上剂量组天然杀伤细胞(NK)细胞活性均出现显著下降 ,以及谷丙转氨酶、尿素的升高。

②荷瘤小鼠 2 0mg/kg体重以上剂量组白细胞计数、巨噬细胞功能显著下降 ,5 0mg/kg体重以上剂量组脾脏指数、NK细胞活性、抗体生成细胞功能均出现显著下降 ,以及谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素的升高。

③正常小鼠注射 60mg/kg体重的CP后 ,血清白细胞介素 2及肿瘤坏死因子均出现显著下降 ;荷瘤小鼠注射 60mg/kg体重的CP后 ,血清白细胞介素 2出现显著下降。

[结论 ]给予C57BL/6J正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔注射 2 0 5 0mg/kg体重的CP ,隔日连续 4 5次 ,即可建立免疫抑制动物模型。

建议采?【总页数】5页(P314-318)【关键词】荷瘤小鼠;免疫抑制;CP;体重;剂量;正常小鼠;环磷酰胺;下降;腹腔注射;抗体生成细胞【作者】高芃;钱嘉林;刘长喜;严卫星【作者单位】中国疾病预防控制中心营养与食品安全所;国家食品药品监督管理局【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R730【相关文献】1.不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响 [J], 张涵淇;王娇;崔圆圆;胡鑫;王德彬;2.小剂量环磷酰胺治愈荷膀胱癌小鼠动物模型的建立 [J], 李墨林;姜妙娜;舒晓宏;崔晓栋;李传刚;贾玉杰3.不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响 [J], 张涵淇;王娇;崔圆圆;胡鑫;王德彬4.环磷酰胺免疫抑制小鼠模型的建立及其在肾包膜下移植中应用 [J], 唐超明;李汉贤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

环磷酰胺在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制的研究

环磷酰胺在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制的研究目的探讨环磷酰胺（CTX）在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制。

方法建立小鼠实体瘤模型和腹水瘤模型:分别在昆明系小鼠皮下接种S180肉瘤细胞、腹腔接种鼠源性H22肝癌细胞，同时给予环磷酰胺处理小鼠，其后观察各组肿瘤生长大小，小鼠存活率的变化；应用Western blot技术检测凋亡抑制基因（Bcl-2）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）含量、抑癌基因P53及P21的蛋白表达。

结果环磷酰胺组肿瘤重量明显低于模型组（P ＜0.05），其抑瘤率为88.55%；小鼠存活天数均较模型组长，其生命延长率为57.73%；环磷酰胺可明显诱导P53的表达，抑制BCL-2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，但对P21没有作用；对瘤体组织中VEGF蛋白表达水平亦有抑制作用。

结论环磷酰胺可通过激活抑癌基因P53，抑制抗凋亡基因Bcl-2和促血管生成因子VEGF等多种途径，发挥抗肿瘤活性，为抗肿瘤动物模型尤其为调节抗肿瘤相关基因表达方面的阳性药物对照提供重要的实验依据。

标签：环磷酰胺；Western blot；S180肉瘤；H22肝癌细胞；抗肿瘤相关基因肿瘤目前是危害人类健康的主要疾病，环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作为一种抗癌谱广、疗效较好的抗癌药物，已广泛应用于临床。

由于该药物的良好抗癌性能，尤其是具有对癌细胞与正常细胞杀伤力差别很大这一特性，使得其在临床得到了广泛应用。

环磷酰胺在细胞水平以及联合用药等方面的研究较多[1-2]，目前肿瘤化疗所应用的大多数药物，都经移植性动物肿瘤试验而被发现，并以此为模型进行疾病发生机制和药物筛选的研究，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型[3]，对研究肿瘤的病因、发病机制、抗癌药物筛选及肿瘤防治等都具有非常重要的意义[4]。

现阶段进行的抗癌药物动物实验研究过程中，多采用环磷酰胺作为阳性对照药物，然而，关于环磷酰胺是否具有调节肿瘤相关基因表达而发挥抗肿瘤作用，尚鲜有人报道。

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1材料与方法1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8荧光抗体)。

1. 2 动物与分组Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。

颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。

动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二:测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血清半数溶血值。

每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和CTX-2 组。

1. 3 实验方法和测定指标1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。

CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。

另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。

动物灌胃容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周后测定各项免疫指标。

1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行测定，每管加入50μl 抗凝血。

分别在3 管中加入CD3 /CD19，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。

每管加入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。

1200r /min 离心5min，弃去上清液。

每管再加入2ml PBS，1200r /min离心5min，弃去上清液。

加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。

1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。

用Hank＇s 液洗2 次，每次离心10min(1000r /min)。

弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。

1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于15ml 离心管中，计数细胞。

加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。

用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴30min。

用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮P815 细胞，室温孵育15 ～ 20min 后，离心1 次。

将P815 悬浮于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 × 106 个/ ml，加0. 5ml 此悬液于含有脾细胞悬液的24 孔( 包括对照孔) 板中。

37℃、5% CO2孵育5 天。

5 天期间，每隔一天换一次液。

1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用Hank’s 液洗1 次，200r /min 离心10min，收集细胞，重悬于RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 × 107 / ml。

用完全培养液配制3 个系列稀释的细胞悬液，每个稀释度100μl，做3 个复孔。

1. 3. 3. 4 制备靶细胞离心处于对数生长期的P815 细胞，重悬于0. 5ml Hank’s 液里，离心后重悬于RPMI1640 完全培养液，调整细胞浓度为2 × 105 个/ml。

1. 3. 3. 5 CTL 检测按效应细胞和靶细胞比为100∶ 1、50∶ 1、25∶ 1和12. 5∶ 1( 各加100μl) 在圆孔96 孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设3 个复孔。

同时设靶细胞自然释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液) 和最大释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40 液) ，效应细胞对照孔(0. 1ml 效应细胞+ 0. 1ml 培养液) ，用96 孔板水平转头500r /min 离心5min，37℃、5% CO2培养4 ～ 6h。

1000r /min离心5min，每孔吸取100μl 上清，加于另一ELISA 反应板的孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50μl，室温避光反应30min 后，每孔加入50μl 终止液，终止酶促反应。

在酶联检测仪492nm 波长下读取各孔A 值，CTL 活性用杀伤率表示，按如下公式计算:CTL 杀伤率(% ) = ( 实验孔A 值－靶细胞对照孔A 值－效应细胞对照孔A 值) / ( 靶细胞最大释放孔A值－靶细胞对照孔A 值) × 100% 。

1. 3. 4 NK 细胞活性测定1. 3. 4. 1 靶细胞传代实验前24h 将靶细胞进行传代培养，应用前以Hank’s 液洗2 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4 × 105 个_______/ml。

1. 3. 4. 2 效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度。

效应细胞的数量为5 × 106 个/ml，效应细胞和靶细胞之比为50∶ 1。

1. 3. 4. 3 NK 细胞活性测定反应孔加靶细胞和效应细胞各100μl 于96 孔U 形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% 的NP40或2. 5% Triton 各100μl，每样做3 个平行样。

37℃、5% CO2 条件下培养4h。

培养结束后，96 孔培养板1500r /min 离心5min，每孔吸取上清100μl 置于平底96 孔板中，同时加入LDH 基质液100μl，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L 的HCl 30μl，在酶标仪490nm 处测定A 值。

用下列公式计算:NK 细胞活性(% ) = ( 反应孔A 值－靶细胞自然释放孔A值) / ( 最大释放孔A 值－靶细胞自然释放孔A 值) × 100% 。

1. 3. 5 半数溶血值的测定(HC50)1. 3. 5. 1 制备补体采集豚鼠血，分离出血清( 至少5 只豚鼠的混合血清) ，将1ml 压积SRBC 加入到5ml 豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－ 70℃保存。

用时以SA 液按1∶ 8稀释。

第3 期齐丽娟，等. 用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型3151. 3. 5. 2 免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞( SRBC) ，并用生理盐水配成2% ( V /V) 的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0. 2ml 进行免疫。

4 ～ 5 天后，由动物眼眶内眦静脉取血，2000r /min 离心10min 收集血清。

1. 3. 5. 3 溶血反应取血清用SA 缓冲液稀释( 一般为200 ～ 500 倍)。

将稀释后的血清1ml 置试管内，依次加入10% SRBC 0. 5ml，补体1ml( 用SA 液按1∶ 8稀释)。

另设不加血清的对照管( 以SA 缓冲液代替)。

置37℃恒温水浴中保温15 ～ 30min 后，冰浴终止反应。

2000r /min 离心10min。

取上清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml 加都氏试剂至4ml，充分混匀，放置10min 后，于540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

按下列公式计算HC50。

HC50 =样品光密度值SRBC 半数溶血时的光密度值×稀释倍数1. 4 统计分析采用SPSS 13. 0 统计软件进行方差分析或非参数检验。

2 结果2. 1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响由表1 可见，CTX-1 组和CTX-2 组小鼠体重较对照组显著降低(P < 0. 001)。

CTX-1 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组增高(P < 0. 001) ，CTX-2 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组降低(P < 0. 001，P < 0. 05)。

表1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响Table 1 The weight and absolute and relativespleen weight in each group( n = 8，珔x ± s)组别体重( g)脾脏绝对重量( g) 相对重量(% )对照组22. 36 ± 1. 06 0. 071 ± 0. 007 0. 319 ± 0. 031 CTX-1 组16. 31 ± 2. 05 (3) 0. 081 ± 0. 018 (1) 0. 505 ± 0. 142 (2)CTX-2 组19. 18 ± 0. 48 (3) 0. 047 ± 0. 009 (2) 0. 243 ± 0. 042 (1)注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P < 0. 0012. 2 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠淋巴细胞分类计数的影响由表2 可见，CTX-1 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B淋巴细胞( CD －3 CD +19) (% )、T 淋巴细胞( CD +3 CD －19) (% )、Th细胞(CD +3 CD +4 CD －8) (% ) 和Ts 细胞( CD +3 CD －4 CD + 8) (% ) 及Th /Ts 比值均较对照组显著降低(P < 0. 05) ;CTX-2 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B 淋巴细胞(% ) 较对照组降低( P < 0. 001) ; CTX-2 组小鼠外周血T 淋巴细胞(% )、Th 细胞(% )、Ts 细胞(% ) 及Th /Ts 比值较对照组增高( P < 0. 001，P < 0. 001，P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 001)。