PCR技术和引物设计
实验五 PCR引物设计及评价
实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
PCR技术和引物设计
PCR技术和引物设计PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
引物设计是PCR技术中的重要步骤，它决定了PCR反应的特异性和效率。
下面将对PCR技术和引物设计进行详细介绍。
PCR技术是由美国科学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明的，他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术利用了DNA的特性：DNA可以通过热变性（denaturation）使双链分离，然后通过低温环境下的适当引物进行互补连接，再通过DNA聚合酶进行扩增。
整个扩增过程可以重复进行多次，从而大幅度增加了DNA的数量。
PCR技术已经在许多领域得到了广泛应用，比如医学诊断、基因工程、遗传疾病研究等。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，将反应体系温度升至94-95摄氏度，使DNA双链变性并分离成两个单链（denaturation）；然后，降低温度至50-60摄氏度，引物与模板DNA互相结合（annealing）；最后，将温度升至72摄氏度，DNA聚合酶在适当条件下扩增DNA片段（extension）。
一次PCR循环一般需要30秒至2分钟，整个PCR过程需要重复数十次至数百次。
在PCR反应中，引物设计至关重要，它决定了PCR反应的特异性和效率。
引物通常是由20-30个核苷酸组成的DNA或RNA片段，其中的序列要与待扩增的DNA靶标序列互补。
引物的设计需要考虑以下因素：1.引物长度：引物长度一般为18-30个碱基，较短的引物具有更好的扩增效率，但其特异性可能降低；较长的引物特异性较好，但扩增效率可能降低。
2.引物的GC含量：引物的GC含量越高，PCR反应的特异性越好。
一般来说，引物的GC含量应在40-60%之间。
3.引物的Tm值：Tm值是指引物与DNA靶标序列之间的解离温度，一般在55-65摄氏度之间。
Tm值的高低决定了引物的特异性，过低的Tm值可能导致引物与非特异DNA片段结合，影响扩增效率和特异性。
PCR技术包含引物设计样本
聚合酶链式反应（PCR）DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下能够变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下,DNA在高温时也能够发生变性解链，当温度降低后又能够复性成为双链。
因此,经过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP就能够完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苗酸引物。
］PCR由变性-退火（复性）-延何三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变烁模板DNA经丽热至94©左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性＞模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至40~60匕左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72°C左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链. 重复循环就可获得更多的”半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2一4分钟,2一3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类(常见)(1)反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR):反向PCR是克隆己知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在己知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与己知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，能够得到大小不同的模板DNA,再经过反向PCR 获得未知片段。
pcr设计方案
PCR设计方案引言PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究和临床诊断的技术。
它能在体外复制DNA序列，并通过放大检测目标DNA的数量。
本文档旨在提供一种PCR设计方案，确保PCR实验的准确性和可靠性。
实验设计此PCR设计方案包括以下步骤：1.靶标选择：选择适合的DNA序列作为PCR反应的靶标。
确保靶标在目标样品中存在且具有生物学意义。
2.引物设计：设计合适的引物，以扩增目标DNA序列。
引物应满足以下要求：–引物长度：一般为18-30个碱基对。
–Tm值：引物的Tm值应接近或略高于PCR反应的最佳温度。
–引物间相互作用：引物对之间不应有明显的互相杂交，以避免产生非特异性扩增产物。
3.杂交温度优化：根据引物的Tm值确定PCR反应的最佳杂交温度。
通常，杂交温度设置为引物Tm值的5°C-10°C。
4.建立PCR反应体系：准备PCR反应体系，包括以下组分：–DNA模板：目标DNA的少量纯化物或DNA提取物。
–引物：前述设计的引物。
–DNA聚合酶：选择具有高稳定性和高扩增效率的DNA聚合酶。
–反应缓冲液：含有适当浓度的Mg^2+离子和其他辅助成分的缓冲液。
–dNTPs：四种单核苷酸。
–模板DNA稀释缓冲液：用于稀释目标DNA的高浓度溶液。
5.PCR扩增条件优化：对PCR扩增条件进行优化，包括：–初始变性步骤：将PCR反应体系加热至94°C-95°C，以解开DNA的双链结构。
–变性步骤：保持高温（94°C-95°C）以保持DNA变性状态。
–环式扩增步骤：设置合适的温度和时间，以使引物与目标DNA杂交并DNA 聚合酶在此温度下进行链延伸。
–末端延伸步骤：进行降温，以使DNA聚合酶完成末端延伸。
6.实验验证：进行PCR扩增并验证扩增产物的特异性。
可通过以下方法进行验证：–凝胶电泳：将PCR反应产物与DNA标准品一同进行凝胶电泳，以确定产物的大小和纯度。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA序列的技术。
引物和探针是PCR中的关键组成部分，它们的设计对PCR的灵敏度和特异性至关重要。
引物是专门设计用于扩增目标DNA序列的两个短链DNA片段。
对于PCR反应的成功与否，引物的设计是至关重要的。
在引物设计中，以下几个因素需要考虑：1.引物长度：引物通常由18-24个碱基组成。
引物过短可能导致非特异扩增，而引物过长可能导致特异扩增低下。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与目标序列之间的碱基配对。
避免引物序列中存在重复和寡聚核苷酸，以防止非特异扩增。
3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物与模板DNA断裂的温度。
引物的Tm值应相似，通常在50-65℃之间。
4.引物之间的互补性：引物之间应避免自身互补或与对方互补，以防止引物形成二聚体或无特异性扩增。
探针是一种带有荧光标记的SSO（特异性杂交寡核苷酸）或DSA（二链特异性杂交寡核苷酸），它能够检测到靶序列的扩增。
探针分为两类：探针（Hydrolysis Probes）和探针（Molecular Beacon Probes）。
1. 探针（Hydrolysis Probes）：这种探针包含一个与靶序列互补的引物和一个结合到引物上的荧光染料和一个淬灭器。
当DNA扩增反应进行时，引物与靶序列结合，使荧光染料与淬灭器距离远离，并发出荧光信号。
这种探针的设计需要考虑引物和探针之间的互补性，以确保特异性扩增和信号产生。
2. 探针（Molecular Beacon Probes）：这种探针是一段独特的DNA 或RNA序列，两端固定一个荧光染料和一个淬灭器。
当探针与靶序列结合时，形成一个折叠的结构，将荧光染料和淬灭器分开。
这种探针的设计需要考虑探针序列的互补性和结构的稳定性。
在引物和探针设计中1.特异性：引物和探针应与目标DNA序列具有高度特异性的互补性，避免与非目标DNA序列发生杂交。
简述pcr引物设计的基本步骤
简述pcr引物设计的基本步骤
PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一步，它直接影响到PCR 反应的特异性和效率。
以下是PCR引物设计的基本步骤：
1. 确定目标序列，首先需要确定要扩增的目标DNA序列，这可以是基因、片段或者其他特定的DNA区域。
2. 引物长度，一般来说，PCR引物的长度应在18-25个碱基对之间，太短会影响特异性，太长则会影响引物的合成效率。
3. 引物的GC含量，引物的GC含量应在40-60%之间，这有助于提高引物与模板DNA的亲和力。
4. 引物特异性，引物应该与目标DNA序列高度特异性地结合，避免与其他非特异性DNA结合。
5. 引物序列的避让，避免引物序列中出现相互补的碱基对，以免引物之间发生非特异性结合。
6. 引物的末端，引物的末端应该避免出现多余的碱基对，以免
影响PCR扩增的效率。
7. 引物的Tm值，引物的熔解温度（Tm值）应该相似，一般来说，它们之间的差异不应超过5摄氏度。
在进行PCR引物设计时，以上这些基本步骤可以帮助确保PCR 反应的特异性和效率。
同时，也可以利用一些生物信息学工具来辅助引物设计，如NCBI的Primer-BLAST、IDT的PrimerQuest等。
PCR引物设计的好坏直接关系到PCR扩增的成功与否，因此在实验前务必进行充分的设计和验证。
pcr技术扩增目的基因的步骤
pcr技术扩增目的基因的步骤
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于扩增特定DNA 片段的技术。
以下是一般PCR 技术扩增目的基因的步骤：
1. 设计引物：根据目的基因的序列，设计一对特异性的引物。
引物是一小段DNA 序列，与目的基因的两端互补。
2. 制备模板DNA：从含有目的基因的样本中提取DNA 作为模板。
可以使用各种方法，如苯酚-氯仿提取法或商业试剂盒。
3. 反应体系准备：将模板DNA、引物、PCR 反应缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶等试剂按照适当的比例混合在一起，形成PCR 反应体系。
4. 热循环：将反应体系放入PCR 仪中，进行热循环。
热循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，模板DNA 被加热至高温，使双链DNA 解开成为单链。
在退火步骤中，温度降低，引物与模板DNA 互补结合。
在延伸步骤中，温度再次升高，DNA 聚合酶开始合成新的DNA 链。
5. 循环次数：热循环通常进行多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
循环次数取决于目的基因的长度和扩增效率。
6. 产物分析：经过一定的循环次数后，PCR 反应产生大量的扩增产物。
可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对产物进行分析，以确认目的基因的扩增。
PCR 技术的具体步骤和条件可能因不同的实验目的和设备而有所差
异。
在进行PCR 实验之前，建议仔细阅读相关的实验指南和操作手册，并根据实际情况进行调整。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增特定的DNA序列。
PCR引物是在PCR反应中使
用的两个短的单链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端
相互互补。
引物的设计是PCR的关键步骤之一。
引物设计的原理考虑了目标DNA序列的多个因素，包括长度、GC含量、互补性和特异性等。
以下是PCR引物设计的一般原理：
1. 引物长度：引物通常由18-30个碱基对组成，这个长度范围
有助于在PCR反应中实现高效的扩增。
过短的引物可能无法
准确地与目标DNA序列的特定区域结合，而过长的引物可能
导致PCR反应较低的产物产量。
2. GC含量：为了确保引物的稳定性和特异性结合，引物的
GC含量应在40-60%之间。
这是因为GC碱基对比AT碱基对
具有更高的结合能力，能够增加引物与目标DNA序列的互补性。
3. 互补性：PCR引物的两个引物应该互补，并形成稳定的引
物-模板DNA复合物。
引物之间的相互互补性可以通过计算引物序列之间的互补碱基数来评估，以确保引物之间没有太多的自身互补性或与其他引物的互补性。
4. 特异性：引物设计还需要确保引物与目标DNA序列具有高
度特异性的互补性。
这意味着引物与目标DNA序列的其他非
目标区域不应该有太多的互补性，以避免非特异性扩增。
引物设计可以使用基因组和引物设计软件来辅助完成。
这些软件基于目标DNA序列的输入，在计算上述因素的基础上，为PCR反应提供最佳的引物设计。
一旦引物设计完毕，它们可以被合成和纯化，并用于PCR扩增特定的DNA序列。
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引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3()，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。
两种法则都假设退火发生于以下标准条件下：50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。
“盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。
最复杂的方法称为“碱基堆积”法。
这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。
计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。
但是，经常需要经验性地估算最佳温度。
55°C 和65°C或极相近的解链温度。
退火温度Tm = 2 °C • (A + T) + 4 °C • (G + C)Tm = 64.9 °C + 41 °C • (G + C -16.4)(A + T + G + C)Tm = 100.5 °C + 41 °C • • 16.6 • log 10([Na +])C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示3引物设计应避免一条引物内的互补性超过3个碱基。
如果不遵循这个法则，那么可能出现使引物不能与其目标序列结合的二级结构。
引物之间的同源性也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3'端。
同源性将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR 反应竞争资源，导致PCR 效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性PCR 产物生成（图1）。
避免互补的引物序列应小心避免在退火步骤期间将PCR 引物的3'端错配。
3'端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。
同时它将提高PCR 效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。
但是，超过3个G/C 碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。
3’-序列A B5’ ACGGATACCA TGCC T A T G 3’5’ ACTTGCATGTCTA GTCAC 3’3’ CAGTG AGTTACATGACTG 5’5’ ACGGATAC CA TGCCTA TG 3’图 1 A B4在两步法RT-PCR 应用中，mRNA 必须转录为cDNA 。
在这种情况下，采用不依赖序列的引物，例如寡（dT ）引物或随机六聚体。
在采用寡（dT ）引物时，推荐选择3'端引物用于以后的PCR 反应。
原因是许多逆转录酶不能高效地将全长mRNA 序列转录到5'端。
图 2 RNA 特异分析是可靠的基因表达定量分析的基础。
PCR product no PCR productupstream primer downstream primerGenomic DNA mRNA RT-PCR ProductB提示锚定的寡（dT）n引物与聚（A）尾部的起点杂交，这样能确保mRNA编码部分的靶向转录。
这是生成全长cDNA的大多数两步RT-PCR应用中较受欢迎的引物延伸法。
提示如果目标序列位于基因的5'dT）n引物的混合物用于逆转录步骤。
一般采用60µM随机六聚体和2.5µM寡（dT）n。
实时PCR为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。
用结合DNA双链的荧光染料（如SYBR Green I）分析时的扩增子长度应短于300 bp，探针分析时的扩增子长度应短于150 bp。
提示PCR条件下运行。
为了达到这一目费的ProbeFinder软件设计，那么最佳退火温度都是60°C。
对于TaqMan®分析的设计，应遵循以下推荐：扩增子长度应小于150 bp。
荧光标记染料不应结合到G-残基，这样可以避免探针的5'端上出现G-残基。
选择能为探针提供C'多于G'的链。
最大TaqMan 探针长度为30个碱基，以获得最佳退火效果。
探针的Tm应介于68-70°C之间。
探针应经HPLC纯化，母液（通常为2-4µM）应在-20°C下等分和保存。
应避免反复冻融（写成冷冻、融化）循环。
（又参见“引物的质量和纯度”）设计引物应在设计完探针后进行。
引物设计应尽可能接近探针而又不与探针重叠。
良好的距离应为距探针3个核苷酸。
引物的Tm应比探针低8-10°C，通常应为至少60°C。
TIP围绕探针设计多个引物。
562-6个碱基，并选择正好在DNA 片EcoR I, BamH I, Kpn I, Xba I ）。
对于ProbeFinder 软件，最佳退火温度都是60°C 。
对于相关生物序列的扩增，例如研究微生物生态学时的普通情况，使用简并引物可能会有帮助。
简并引物是相似寡核苷酸的混合物，具有相同序列—除了所选的（简并）位置以外—并使得相似的序列被共同扩增。
简并引物也能用于引物设计必须基于蛋白质序列时。
简并引物锁核酸（LNA ）是核苷酸类似物，其中核糖环由亚甲基桥封闭。
LNA-核苷酸与其互补碱基配对。
其优势在于LNA-核苷酸增加寡核苷酸的解链温度，每个LNA 单体可增加2-8°C ，从而比标准寡核苷酸提高了专一性。
这个优势可用于一系列不同的应用，尤其是在微小RNA 的定量分析中或在Universal ProbeLibrary 通用型探针的使用中。
LNA 引物如果必须引入限制性位点，那么应在引物的5'端进行。
克隆O O O O O O P B LNA 8-mer5’-TGC T GGTC-3’3’-ACG A CCAC-5’3’-ACG G CCAC-5’T mPerfect Match SingleMismatchO O O OO P BDNA 8-mer5’-TGC T GGTC-3’71 °C 35 °C 45 °C 25 °C 26 °C10 °C提示引物的质量和纯度引物的质量和纯度茎环引物茎环引物主要用于逆转录期间，以便后面进行微小RNA的量化分析。
茎环引物结合到微小RNA的3'端，这样它可由逆转录酶进行转录。
然后借助于微小RNA特异性正向引物、逆向引物和水解探针（TaqMan 探针），可以对RT产物进行定量分析（Chen等人,2005）。
引物的质量和纯度如果可能的话，应只采用高度纯化的引物（例如HPLC纯化）。
在非纯化引物样品中，总会存在较短的片段，这是引物合成期间生成的副产物。
这些副产物将促进引物二聚体的形成，并将降低PCR反应的敏感性和产量。
提示PCR产物，PCR反应中应始终采用HPLC纯化引物，以及具有热启动功能的聚合酶。
FastStart Taq聚合酶，dNTPack和FastStart高保真PCR系统，dNTPack以及所有FastStartUniversal SYBR Green、LightCycle 480/2.0系列的SYBR Green Master Mix或Probes MasterMix都含有经过化学修饰的酶，这些酶在75°C以下将失活。
在PCR开始时，95°C下短时Transcriptor一步式RT-PCR PCR期间的引物二聚体，从而提高专一性。
引物通常以冻干制剂提供。
它们可以保存在2-8°C的冰箱中。
引物母液应在-20°C下等分和保存。
应避免反复的冷冻、融化循环。
提示为了生成浓缩母液（例如100µM），应采用以不含核酸酶的水配制的、适合于PCR的低浓度无菌Tris缓冲液（5-10µM，pH 7-8）。
纯水的缺点是没有缓冲能力。
这样， pH值将经常处于4-5的范围内。
引物在这个pH值下不稳定。
应避免TE缓冲液，因为它含有会结合Mg2+离子的EDTA，而Mg2+离子是PCR反应中的主要成分。
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