引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一．流程图二．确定模板1.确定模板来源物种近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。
如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。
如下图。
另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考/refseq/about/。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列三．寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对
一步一步教你使用NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST 序列比对等最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在NCBI 上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI 的使用。
希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下NCBI 的使用：Part one 如何查找基因序列、mRNA、PromoterPart two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列Part four 如何运用BLAST 进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。
引物设计具体步骤
引物设计一、引物设计简介引物设计是以一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的起点而起作用的多核苷酸链。
我们根据根据蛋白的基因序列及所选取的目的片段，设计引物。
二、引物设计的一般原则（一）抗原性：引物设计在完整的Domain区域或者抗原表位集中区域；（二）PCR产物长度：PCR产物长度不应过长，最佳长度为500bp左右。
；（三）长度：15-30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR 的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃)，从而降低产物的特异性；（四）GC含量：应在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5℃；（五）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。
尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发；（六）互补、错配、二级结构：引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
两个引物之间不应有多于4个互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；（七）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，应尽量避免3’端发生错配。
而且尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T；（八）特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
三、常用软件DNAman5，Primer Preimer5，DNAStar/EditSeq、Snapgene四、信息检索常用数据库（一）uniprot（二）ncbi五、引物设计流程以蛋白Actin Beta的Met1-Phe375为例，说明引物设计具体流程：（一）根据蛋白名称或uniprot等信息，点开uniprot数据库；（二）在uniprot数据库中最左侧的菜单栏中，点击“sequence”，找到氨基酸序列；注：若此蛋白有多个isoform，一般以isoform1的序列为准设计引物（三）在“sequence databases”中找到这个蛋白对应的NM号；注：每一个isoform对应唯一一个NM号（四）点击NM号，进入NCBI数据库，找到对应的CD S序列，图中棕色部分即为此蛋白的碱基序列，根据研究需要，截取对应片段长度，如氨基酸片段为1-375，则碱基序列为1-1125；（五）打开Primer Preimer5引物设计软件，输入选取的碱基序列，点击“Primer”示anti-sense；再点击“Edit Primers”进行编辑；（七）当信息栏显示的发夹结构、二聚体、错配等信息为“None”时，初步认为此引物为最佳选择；（八）进入NCBI数据库，点击“BLAST”，选择“Primer-BLAST”，再次分析确认此引物是否为最佳引物。
全基因扩增的引物设计步骤
全基因扩增的引物设计步骤引言全基因扩增（Whole Genome Amplification，WGA）是一种将整个基因组进行扩增的技术，可以从极少量的DNA样本中获得足够的DNA量进行后续实验。
在全基因扩增过程中，引物设计是至关重要的一步，它直接影响扩增效率和特异性。
本文将详细介绍全基因扩增的引物设计步骤。
引物设计步骤1. 确定扩增目标在进行全基因扩增之前，首先需要确定扩增的目标。
可以是整个基因组的扩增，也可以是特定区域的扩增。
根据扩增目标的不同，可以选择不同的引物设计策略。
2. 引物长度选择引物的长度对扩增效率和特异性有重要影响。
通常，引物的长度在18-30个碱基对之间。
较短的引物可以提高扩增效率，但可能会导致非特异性扩增产物的产生；较长的引物可以提高特异性，但可能会降低扩增效率。
3. 引物序列选择引物序列的选择是引物设计中最关键的一步。
以下是引物序列选择的几个要点： - 引物应具有足够的特异性，避免非特异性扩增产物的产生。
可以通过比对基因组数据库或使用引物设计软件来评估引物的特异性。
- 引物的GC含量应适中，一般在40-60%之间。
过高或过低的GC含量可能会影响扩增效率。
- 引物的3’端应尽量避免出现重复序列或富含AT或GC碱基对的序列，以减少扩增的非特异性。
- 引物的3’端还可以加入一些特定的序列，如限制性酶切位点、引物标签等，以方便后续实验操作。
4. 引物的互补性检查在引物设计完成后，需要进行引物的互补性检查。
引物之间的互补性可能会导致二聚体的形成，影响扩增效率和特异性。
可以使用引物设计软件或进行体外实验来检查引物之间的互补性。
5. 引物的合成合成引物时，可以选择商业合成或自行合成。
在合成引物时，需要注意以下几个问题： - 引物的纯度要求较高，以避免污染对扩增结果的影响。
- 引物的浓度要适中，一般在10-100 μM之间。
引物设计实例以下是一个全基因扩增引物设计的实例：1.扩增目标：整个基因组的扩增。
引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一．流程图二．确定模板1.确定模板来源物种近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。
如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。
如下图。
另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考/refseq/about/。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列三．寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
引物设计的原则汇总中 -有重复的段落
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度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物
，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单
计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对
不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值
引物设计的原则汇总中 （有重复的段落） - 日志 - 快乐的小麻雀 - 我的空间 - Powered by UCenter Home
。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有3个 ，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method ，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详 细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正 确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。 ⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且 给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级 结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较 小，基本可以接受。 ⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开 的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、 二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。 4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序 列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可 以。 二、引物设计过程中的心得 1、Primer 5.0搜索引物 ①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。 ②PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不 好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 ③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数 默认就可以了。 ④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可 以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作 为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意 的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 2、Oligo 6.0评估引物 ①在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Di mer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温 度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问 题。 ②Hairpin Formation根据黄金法则 ③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 ④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的 时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 ⑤Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于 稳定。 下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放 到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 3、其他 ①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合 退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 ②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了 ，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 ③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例 外，不是1＋1＝2那么确定。 ④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。 ⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。 所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。
简述pcr引物设计的基本步骤
简述pcr引物设计的基本步骤
PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一步，它直接影响到PCR 反应的特异性和效率。
以下是PCR引物设计的基本步骤：
1. 确定目标序列，首先需要确定要扩增的目标DNA序列，这可以是基因、片段或者其他特定的DNA区域。
2. 引物长度，一般来说，PCR引物的长度应在18-25个碱基对之间，太短会影响特异性，太长则会影响引物的合成效率。
3. 引物的GC含量，引物的GC含量应在40-60%之间，这有助于提高引物与模板DNA的亲和力。
4. 引物特异性，引物应该与目标DNA序列高度特异性地结合，避免与其他非特异性DNA结合。
5. 引物序列的避让，避免引物序列中出现相互补的碱基对，以免引物之间发生非特异性结合。
6. 引物的末端，引物的末端应该避免出现多余的碱基对，以免
影响PCR扩增的效率。
7. 引物的Tm值，引物的熔解温度（Tm值）应该相似，一般来说，它们之间的差异不应超过5摄氏度。
在进行PCR引物设计时，以上这些基本步骤可以帮助确保PCR 反应的特异性和效率。
同时，也可以利用一些生物信息学工具来辅助引物设计，如NCBI的Primer-BLAST、IDT的PrimerQuest等。
PCR引物设计的好坏直接关系到PCR扩增的成功与否，因此在实验前务必进行充分的设计和验证。
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PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一．流程图二．确定模板1.确定模板来源物种近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。
如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。
如下图。
另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考/refseq/about/。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列三．寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
在扩增基因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因。
因此，在引物设计前需先找出目的序列中的保守区域。
在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物。
1.制作mega标准序列A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单File →Load Sequences），然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment，此时将保存两种格式文件：.dnd和.aln（序列较长时耗时较长，需数分钟）。
B.将以上.aln文件用DAMBE软件打开（File→Open standard sequence file），注意选择恰当的序列类型。
打开后的文件可直接转存为.meg或.fas格式文件（File→Save or Convert Sequence Format）。
注1：此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为U。
2.Mega分析同源性A.用Mega软件打开以上保存的.meg或.fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口（Align→Edit/BuildAlignment→Retrieve sequences from a file）。
B.在新窗口中以默认设置将序列集进行序列对齐分析（Alignment→Align by muscle（Codons）），结果保存为.fas文件（Data →Export Alignment）。
C.打开网址http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms::boxshade进入在线软件BOXShade，在选择文件按钮下载入以上已对齐的模板.fas文件。
点击advanced options按钮展开选项，将默认设置进行如下图修改。
其余选项保持默认即可，也可根据实际需要进行调整。
设置完后点击Run提交任务。
注2：should sequence name be printed项的默认设置为YES，此时将把序列名同时打印。
需再输出的富文本文件中将字体全部改为中文字体，才能保持序列的对齐。
如需英文字体，此项可以改为no，序列名可以通过其他方式添加。
在软件输出结果的报告页面中保存.rtf格式的富文本文件，该文件可用Microsoft Word编辑。
3.保守区域的分析如下图，consenus行表示序列间的一致性，*号表示在序列间完全一致的碱基，.号表示在序列间高度相似的碱基，空格表示在序列间；consenus行之上每一行分别代表一个物种的PHIP基因序列，蓝色背景的碱基为在物种间保守的碱基。
首先观察consenus行，*号比例在50%以上且空格很少的区域可视作保守区域，具体分析中应灵活处理。
以PHIP基因为例，保守区域可划分为：190-1240bp，1260-1980bp，2000-2290bp，2540-4920bp，5340-5740bp。
注3：出现连续的长的不保守区域（大于数百bp），因为引物设计产物的最佳长度上限在1000左右。
此时可以只考虑近亲物种序列的保守性，降低保守区域的分析标准。
4.绘制引物设计示意图注4：对于PHIP基因，我们顺利的得到了保守性区域分析结果。
但是，对于某些进化较快的基因，保守性区域可能不足够用于设计引物。
此时，可以逐渐减少用于分析的远缘物种，采用渐进性的分析，直到得到能够设计引物的保守性区域。
注5：为什么是mega ？保守性区域的分析用其他软件（如DNAMAN）也可进行。
采用mega的原因在于其分析方法的可靠性更高，同时该软件在进化分析等中也非常常用，所以将mega可读序列的制作一并说明。
四．用Primer5 软件设计引物1.新建文件，导入模板确定一条序列为设计引物的模板序列。
本例中根据进化关系，选择鸭的PHIP基因序列为模板。
在Primer5软件中新建一个窗口（File → New → DNA Sequnce），将模板序列粘贴（ctrl+v）在窗口内（一般选择as is表示粘贴原序列，也可根据需要粘贴反向序列等）。
2.设置参数，搜索引物在新序列窗口中点击按钮进入引物设计窗口，如下图。
在引物设计窗口中点击按钮进入引物搜索窗口，如下图。
引物类型为PCR Primers ，搜索类型一般选择成对引物，在搜索范围内限制搜索上下游引物的序列区域（参考前面的保守区域进行设置），产物长度，引物长度设置详见后续介绍。
搜索模式分为自动的Automatic和手动的Manual，在自动模式下引物搜索由严格标准往宽松标准执行，直至引物条数/对数达到设定值，其搜索参数设置如下图，搜索参数为在搜索过程中排除不合格引物的筛选条目；在手动模式下，可设置搜索的严格程度，并可修改搜索参数条目下的限定数值。
在引物搜索窗口设置好后点击按钮开始搜索，搜索结果如下图。
在搜索结果中可分别查看上下游引物或成对引物的情况。
Rating值代表系统对引物的（产物）打分，分值越高说明引物越优秀，但并不是绝对的评价标准。
引物具体信息在点击引物所在行后在引物设计窗口显示，其中：按钮为选择显示上游或下游引物信息；Seq No表示引物第一个碱基在序列中的位置；Length表示引物/产物长度；Tm表示引物/产物的熔解温度；GC%表示引物/产物的GC含量；△G表示引物结合模板过程的自由能；Activity表示引物与结合的效率；Degeneracy表示引物的多义性；T a O p t表示P r i m e r5软件建议的成对引物扩增时的最佳退火温度。
Hairpin表示引物可能形成的二级结构；Dimer表示引物自身可能形成的二聚体；False Priming引物与模板的错频；Cross Dime引物间可能形成的二聚体表示。
以上项目即为分析引物时的参考条目，引物设计的一些原则整理见后续。
参照引物设计的原则即可根据Primer5中上述参数对引物对进行选择。
另，对于一些引物，可能出现大多数指标都较为优秀，但个别指标严重影响扩增反应的情况。
这种引物可使用按钮，手动的对其进行修改以提高其性能。
3.引物设计原则1)引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于75℃，即Taq酶的最适温度。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
2)产物长度：扩增片段长度取决于酶的活性和保真性能。
对于普通Taq聚合酶，PCR产物一般不超过2000bp，而在100-1000bp范围效果较佳，超过1000bp的产物就可能出现产物量降低甚至无法扩增的情况。
对于其他酶，应根据相关说明使用。
3)引物Tm值：引物的Tm值，指的是50%的引物分子和其互补序列表现为双链时的温度，PCR时的退火温度一般都要比Tm值低5℃左右以确保有效退火。
引物的Tm值一般控制在55-65度, 一般需保证上下游引物的Tm值差不超过4-6度。
如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。
许多软件可以对Tm进行计算，其计算原理各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
4)GC%：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC%对扩增的影响主要通过Tm值来体现，当Tm值符合要求时，对于GC%不必做严格要求。
另，引物序列中同一碱基连续出现不应超过5个。
5)引物3’端：引物3’端是延伸开始的地方，最好不存在错配。
同时3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
同时，3’端有形成二级结构/二聚体的可能对于PCR扩增的影响将大于5’端。
在扩增编码区域时，引物3′端最好不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
6)△G值：引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低的引物，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应（寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol，通常就是专一性的探针或引物）。
7)引物的二级结构/二聚体：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。