引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
从puc质粒中扩增lacz引物设计primer步骤
从puc质粒中扩增lacz引物设计primer步骤
扩增 lacZ 引物设计 primers 的步骤
一、准备工作
2、准备相关知识
要熟悉 lacZ 基因引物的相关知识，包括 lacZ 基因的结构、它们的
编码区域以及其他情况。
二、设计 primers
1、检索 lacZ 基因的序列
使用 NCBI 的 BLAST 来检索 lacZ 基因的序列，以得到正确的序列。
2、设计primers
使用软件如 OligoCalc 中的 Primer Design 功能，设计适合 lacZ
基因上下游的引物，以完成正确的 PCR 反应。
一般情况下，一对引物的
长度应该在 18-24 bp 之间，Tm 值应该在 60-64 度之间。
3、校验 primers
使用软件如 Primer 3 中的 Primer Analysis 功能，校验所设计出
的引物对是否满足一定要求。
三、实验测试
1、样品提取
根据实验需求，从pUC质粒中提取相应的样品进行实验。
2、PCR实验
使用上述设计的引物对，进行PCR扩增实验，以确认引物对的有效性。
3、结果分析
从PCR实验中得到的结果，对其进行分析。
如果扩增的片段同预期一致，则表明引物设计正确；如果与预期不一致，则表明引物设计不正确，
需要进行重新设计。
以上就是 lacZ 引物设计 primers 的步骤，通过这些步骤可以为
pUC 质粒中的 lacZ 基因扩增准备相应的 primers 对。
CRISP设计基因靶点引物步骤
CRISP设计基因靶点引物步骤一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1确定待敲除基因的靶位点1.2设计识别靶位点的识别的一对DNA0ligo（引物）1.3构建表达sgRNA的质粒1.4sgRVA活性检测1.5利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA0ligos确定待敲除位点后，选择23一至250bp的外显子序列输入到，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
PCR引物设计
引物设计要点
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模 板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况 下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正 弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相 对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此 则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物 与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的 整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响 DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
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序列综合分析
Vector NTI Suite 8.0 Omiga 2.0 DS gene DNASIS for Windows 2.5 DNATools 5.1 Bioedit DNAMAN
10
蛋白分析软件
蛋白二级结构分析： ANTHEPROT 4.5 、 Peptool、 VHMPT （Viewer and editor for Helical Membrane Protein Topologies）、 MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench, MACAW) 三维结构显示：RasMol、Cn3D、CHIME 2.6 IE、 POV-Ray 3.5
引物的设计流程
引物的设计流程Designing primers for PCR (polymerase chain reaction) is a crucial step in molecular biology research. 引物的设计对于PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中至关重要的一步。
It involves carefully selecting short, single-stranded DNA sequences that will bind to the target DNA and initiate the amplification process. 这涉及仔细选择短的、单链的DNA序列，这些序列将与目标DNA结合并启动扩增过程。
The design process requires attention to detail to ensure the success of the PCR experiment.设计的过程需要细致入微的关注，以确保PCR实验的成功。
To achieve this, several key considerations must be taken into account.为了达到这一目的，必须考虑几个关键因素。
These include the length and melting temperature of the primers, as well as any potential secondary structures or primer-dimer formations.这些因素包括引物的长度和熔解温度，以及任何潜在的二级结构或引物二聚体形成。
One of the most important aspects of primer design is ensuring that the primers specifically bind to the target DNA sequence. 引物设计最重要的一个方面是确保引物能够特异性地结合到目标DNA序列。
引物设计——手把手教新手
引物设计——手把手教新手引物设计是指在实验室中用于特定目的的DNA序列，用于扩增特定的DNA片段。
引物设计在分子生物学研究和遗传工程方面起着至关重要的作用。
对于新手来说，如何设计合适的引物是一个基础且重要的技能。
下面将以一种扩增人类基因的引物设计为例，手把手地教新手进行引物设计。
首先，我们需要确定扩增的目标基因。
假设我们的目标基因是人类TNF-α基因。
TNF-α是一种调节免疫反应的细胞因子，与一些疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病等密切相关。
因此，深入研究TNF-α基因的功能和表达是非常重要的。
第二步是获取TNF-α基因的序列。
我们可以在公共数据库如NCBI （National Center for Biotechnology Information）中人类TNF-α基因的序列。
在NCBI的网站上，可以输入关键词“human TNF-alpha gene sequence”，并选择合适的结果进行。
我们可以找到人类TNF-α基因的RefSeq基因组序列。
然后，我们需要对所获得的基因序列进行分析，以确定扩增的目标区域。
在TNF-α基因中，选择合适长度的外显子或启动子区域作为目标区域进行扩增。
在选择时，需要考虑该区域的特异性和扩增效率。
接下来，我们需要使用一些在线工具来进行引物设计。
有许多免费的引物设计工具可供选择，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等。
在这里，我们将使用Primer3进行引物设计。
在Primer3的网站上，可以将TNF-α基因的目标区域序列粘贴到“SEQUENCE INPUT”输入框中。
然后，可以设置一些参数，如引物长度、Tm值、GC含量等。
对于引物长度，通常选择18-25个核苷酸；Tm值通常在55-65°C之间；GC含量通常在40-60%之间。
设置好参数之后，点击“PICK PRIMERS”按钮，即可获得计算结果。
得到计算结果后，将得到一对引物的序列和其他相关信息，如引物的Tm值、GC含量、特异性等。
简述pcr引物设计的基本步骤
简述pcr引物设计的基本步骤
PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一步，它直接影响到PCR 反应的特异性和效率。
以下是PCR引物设计的基本步骤：
1. 确定目标序列，首先需要确定要扩增的目标DNA序列，这可以是基因、片段或者其他特定的DNA区域。
2. 引物长度，一般来说，PCR引物的长度应在18-25个碱基对之间，太短会影响特异性，太长则会影响引物的合成效率。
3. 引物的GC含量，引物的GC含量应在40-60%之间，这有助于提高引物与模板DNA的亲和力。
4. 引物特异性，引物应该与目标DNA序列高度特异性地结合，避免与其他非特异性DNA结合。
5. 引物序列的避让，避免引物序列中出现相互补的碱基对，以免引物之间发生非特异性结合。
6. 引物的末端，引物的末端应该避免出现多余的碱基对，以免
影响PCR扩增的效率。
7. 引物的Tm值，引物的熔解温度（Tm值）应该相似，一般来说，它们之间的差异不应超过5摄氏度。
在进行PCR引物设计时，以上这些基本步骤可以帮助确保PCR 反应的特异性和效率。
同时，也可以利用一些生物信息学工具来辅助引物设计，如NCBI的Primer-BLAST、IDT的PrimerQuest等。
PCR引物设计的好坏直接关系到PCR扩增的成功与否，因此在实验前务必进行充分的设计和验证。
引物设计原理及详细步骤
引物设计原理及详细步骤引物设计是⼀⼩段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进⾏延伸的出发点⽽起作⽤的多核苷酸链。
引物设计原理及详细步骤：1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的⽐较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同⼀基因，通过序列分析软件（⽐如DNAman）⽐对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2、引物长度⼀般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常⽤的是18-27bp，但不应⼤于38bp，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进⾏反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在⼀定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，⼀般⾼于Tm值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码⼦的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终⽌于密码⼦的第3位，因密码⼦的第3位易发⽣简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很⼤的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，⽽当末位链为T时，错配的引发效率⼤⼤降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的⼀种⽅法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
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PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一．流程图二．确定模板1.确定模板来源物种近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。
如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。
2.利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页/，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。
B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。
基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。
如下图。
另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考/refseq/about/。
C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。
D.如需得到该基因所在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products 条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。
E.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show 条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。
3.整理下载的模板序列三．寻找保守区域保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。
在扩增基因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因。
因此，在引物设计前需先找出目的序列中的保守区域。
在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物。
1.制作mega标准序列A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单File →Load Sequences），然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment，此时将保存两种格式文件：.dnd和.aln（序列较长时耗时较长，需数分钟）。
B.将以上.aln文件用DAMBE软件打开（File→Open standard sequence file），注意选择恰当的序列类型。
打开后的文件可直接转存为.meg或.fas格式文件（File→Save or Convert Sequence Format）。
注1：此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为U。
2.Mega分析同源性A.用Mega软件打开以上保存的.meg或.fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口（Align→Edit/BuildAlignment→Retrieve sequences from a file）。
B.在新窗口中以默认设置将序列集进行序列对齐分析（Alignment→Align by muscle（Codons）），结果保存为.fas文件（Data →Export Alignment）。
C.打开网址http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms::boxshade进入在线软件BOXShade，在选择文件按钮下载入以上已对齐的模板.fas文件。
点击advanced options按钮展开选项，将默认设置进行如下图修改。
其余选项保持默认即可，也可根据实际需要进行调整。
设置完后点击Run提交任务。
注2：should sequence name be printed项的默认设置为YES，此时将把序列名同时打印。
需再输出的富文本文件中将字体全部改为中文字体，才能保持序列的对齐。
如需英文字体，此项可以改为no，序列名可以通过其他方式添加。
在软件输出结果的报告页面中保存.rtf格式的富文本文件，该文件可用Microsoft Word编辑。
3.保守区域的分析如下图，consenus行表示序列间的一致性，*号表示在序列间完全一致的碱基，.号表示在序列间高度相似的碱基，空格表示在序列间；consenus行之上每一行分别代表一个物种的PHIP基因序列，蓝色背景的碱基为在物种间保守的碱基。
首先观察consenus行，*号比例在50%以上且空格很少的区域可视作保守区域，具体分析中应灵活处理。
以PHIP基因为例，保守区域可划分为：190-1240bp，1260-1980bp，2000-2290bp，2540-4920bp，5340-5740bp。
注3：出现连续的长的不保守区域（大于数百bp），因为引物设计产物的最佳长度上限在1000左右。
此时可以只考虑近亲物种序列的保守性，降低保守区域的分析标准。
4.绘制引物设计示意图注4：对于PHIP基因，我们顺利的得到了保守性区域分析结果。
但是，对于某些进化较快的基因，保守性区域可能不足够用于设计引物。
此时，可以逐渐减少用于分析的远缘物种，采用渐进性的分析，直到得到能够设计引物的保守性区域。
注5：为什么是mega ？保守性区域的分析用其他软件（如DNAMAN）也可进行。
采用mega的原因在于其分析方法的可靠性更高，同时该软件在进化分析等中也非常常用，所以将mega可读序列的制作一并说明。
四．用Primer5 软件设计引物1.新建文件，导入模板确定一条序列为设计引物的模板序列。
本例中根据进化关系，选择鸭的PHIP基因序列为模板。
在Primer5软件中新建一个窗口（File →New →DNA Sequnce），将模板序列粘贴（ctrl+v）在窗口内（一般选择as is 表示粘贴原序列，也可根据需要粘贴反向序列等）。
2.设置参数，搜索引物在新序列窗口中点击按钮进入引物设计窗口，如下图。
在引物设计窗口中点击按钮进入引物搜索窗口，如下图。
引物类型为PCR Primers ，搜索类型一般选择成对引物，在搜索范围内限制搜索上下游引物的序列区域（参考前面的保守区域进行设置），产物长度，引物长度设置详见后续介绍。
搜索模式分为自动的Automatic和手动的Manual，在自动模式下引物搜索由严格标准往宽松标准执行，直至引物条数/对数达到设定值，其搜索参数设置如下图，搜索参数为在搜索过程中排除不合格引物的筛选条目；在手动模式下，可设置搜索的严格程度，并可修改搜索参数条目下的限定数值。
在引物搜索窗口设置好后点击按钮开始搜索，搜索结果如下图。
在搜索结果中可分别查看上下游引物或成对引物的情况。
Rating值代表系统对引物的（产物）打分，分值越高说明引物越优秀，但并不是绝对的评价标准。
引物具体信息在点击引物所在行后在引物设计窗口显示，其中：按钮为选择显示上游或下游引物信息；Seq No表示引物第一个碱基在序列中的位置；Length表示引物/产物长度；Tm表示引物/产物的熔解温度；GC%表示引物/产物的GC含量；△G表示引物结合模板过程的自由能；Activity表示引物与结合的效率；Degeneracy表示引物的多义性；Ta Opt表示Primer5软件建议的成对引物扩增时的最佳退火温度。
Hairpin表示引物可能形成的二级结构；Dimer表示引物自身可能形成的二聚体；False Priming引物与模板的错频；Cross Dime引物间可能形成的二聚体表示。
以上项目即为分析引物时的参考条目，引物设计的一些原则整理见后续。
参照引物设计的原则即可根据Primer5中上述参数对引物对进行选择。
另，对于一些引物，可能出现大多数指标都较为优秀，但个别指标严重影响扩增反应的情况。
这种引物可使用按钮，手动的对其进行修改以提高其性能。
3.引物设计原则1)引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于75℃，即Taq酶的最适温度。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
2)产物长度：扩增片段长度取决于酶的活性和保真性能。
对于普通Taq聚合酶，PCR产物一般不超过2000bp，而在100-1000bp范围效果较佳，超过1000bp的产物就可能出现产物量降低甚至无法扩增的情况。
对于其他酶，应根据相关说明使用。
3)引物Tm值：引物的Tm值，指的是50%的引物分子和其互补序列表现为双链时的温度，PCR时的退火温度一般都要比Tm值低5℃左右以确保有效退火。
引物的Tm值一般控制在55-65度, 一般需保证上下游引物的Tm值差不超过4-6度。
如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。
许多软件可以对Tm进行计算，其计算原理各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
4)GC%：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC%对扩增的影响主要通过Tm值来体现，当Tm值符合要求时，对于GC%不必做严格要求。
另，引物序列中同一碱基连续出现不应超过5个。
5)引物3’端：引物3’端是延伸开始的地方，最好不存在错配。
同时3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
同时，3’端有形成二级结构/二聚体的可能对于PCR扩增的影响将大于5’端。
在扩增编码区域时，引物3′端最好不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
6)△G值：引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低的引物，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应（寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol，通常就是专一性的探针或引物）。
7)引物的二级结构/二聚体：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。