第三讲 利用基因芯片进行基因表达谱分析
基因表达谱芯片
基因表达谱芯片（Gene Expression Microarray），简称基因芯片，是一种高通量的基因分析技术，它可以同时检测数千个基因的表达水平。基因芯片的核心是由成千上万的探针组成的芯片，每个探针可以检测一个特定的基因的表达水平。通过对样本进行处理和标记，然后与芯片上的探针进行杂交和检测，可以获得每个基因的表达水平数据。
基因芯片的应用非常广泛，特别是在生命科学领域中。它可以用于研究不同生物条件下基因表达的变化，探索基因调控机制，发现新的基因标记，甚至可以用于疾病的早期诊断和治疗。除此之外，基因芯片还可以应用于农业、环境、食品安全等领域。
基因芯片技术的优点是可以同时检测大量基因的表达水平，从而提高研究效率和减少研究成本。此外，基因芯片还可以在不需要繁琐实验和检测的情况下，快速、准确地得到大量基因表达数据。这些数据可以用于建立基因表达谱和生物信息学分析，从而发现新的基因调控机制，识别疾病相关基因和生物标志物，提高研究和诊断水平。
基于生物芯片的基因表达谱分析
基于生物芯片的基因表达谱分析随着基因组学、转录组学和蛋白质组学等生物学领域的发展，越来越多的研究人员开始采用生物芯片技术进行基因表达谱分析。
生物芯片技术是在芯片上固定一定数量的DNA片段或蛋白质，通过检测样本中的RNA或蛋白质与芯片上的DNA或蛋白质的相互作用来分析样本中的基因表达谱或蛋白质表达谱。
生物芯片技术基于基因表达谱分析的原理是，通过将一系列已知的基因片段（例如cDNA，基因组片段或寡核苷酸探针）安置在芯片上，样本RNA会与这些基因片段特异性结合，从而确定样本中某个基因的表达水平。
生物芯片技术可以高效地测定上千个基因的表达谱，进而了解基因调控网络以及与疾病相关的生命体征。
生物芯片技术主要分为两种：DNA芯片与蛋白芯片。
DNA芯片主要用于分析基因表达谱，蛋白芯片主要用于分析蛋白质表达谱。
这两种芯片都是由数千个小点（探针）组成的。
探针设计取决于研究对象及其应用范围。
一般来说，探针的选择基于研究问题，例如从特定生长条件中获得的医学样品，以及特定基因家族和参考数据集等。
DNA芯片是固相合成的高密度芯片，是一种半导体平台，通常由玻璃或硅基底衬、探针耗材面层、链接层、反应室、ALD制作的陶瓷基底（用于QPCR Array）等组成。
DNA芯片基于杂交实验原理开发，样本RNA的互补DNA探针将配对到DNA芯片上的探针，从而量化RNA表达。
蛋白芯片是一种高通量蛋白质分析技术，通过对样本中的蛋白质与芯片上含有多种蛋白质的检测探针相互作用，实现对样本中蛋白质表达谱的检测。
蛋白芯片构成如DNA芯片类似，由各种芯片片段组成。
特定蛋白质标记或DNA/ RNA片段在芯片上呈现出不同颜色或荧光，从而可以进行定量分析。
基于生物芯片的基因表达谱分析有以下特点：1. 高通量生物芯片技术可以在单个实验中测量数千种基因的表达谱，一定程度上有助于高通量数据处理和分析。
因此，可以更快速地有效地解读大规模数据，并挖掘出潜在的有意义的基因信息。
第三讲利用基因芯片进行基因表达谱分析
• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
新一代芯片技术 光纤微珠芯片
Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays,
Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287,
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair
Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
• Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs • Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch
核苷酸的修饰方法
• 生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]的结合进行检测， 标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简 单方便，扫描成本较低。
• 荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP ，Cy5-的dNTP • 同位素标记的dNTP • amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和
生物信息学讲义——基因芯片数据分析
生物信息学讲义——基因芯片数据分析生物信息学是指运用计算机技术和统计学方法来解析和理解生物领域的大规模生物数据的学科。
基因芯片数据分析是生物信息学研究的一个重要方向，通过对基因芯片数据进行分析，可以揭示基因在生物过程中的功能和调节机制。
本讲义将介绍基因芯片数据的分析方法和应用。
一、基因芯片数据的获取与处理基因芯片是一种用于检测和测量基因表达水平的高通量技术，可以同时检测上千个基因的表达情况。
获取基因芯片数据的第一步是进行基因芯片实验，如DNA芯片实验或RNA芯片实验。
实验得到的数据一般为原始强度值或信号强度值。
接下来，需要对这些原始数据进行预处理，包括背景校正、归一化和过滤噪声等步骤，以消除实验误差和提高数据质量。
二、基因表达分析基因芯片数据的最主要应用之一是进行基因表达分析。
基因表达分析可以揭示在不同条件下基因的表达模式和差异表达基因。
常用的基因表达分析方法包括差异表达分析、聚类分析和差异共表达网络分析等。
差异表达分析常用来寻找在不同条件下表达差异显著的基因，如差异表达基因的筛选和注释；聚类分析可以将表达模式相似的基因分为一组，如聚类分析可以将不同样本中的基因按照表达模式进行分类；差异共表达网络分析可以找到一组在差异表达样本中共同表达的基因，揭示潜在的功能模块。
三、功能富集分析对差异表达基因进行功能富集分析可以帮助我们理解这些基因的生物学功能和参与的生物过程。
功能富集分析可以通过对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)注释，找到在特定条件下富集的生物学过程、分子功能和细胞组分等。
另外，功能富集分析还可以进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，找到差异表达基因在代谢通路和信号传导通路中的富集情况。
四、基因调控网络分析基因调控网络分析可以帮助我们揭示基因间的调控关系和寻找关键调控基因。
基因调控网络是基于差异表达数据构建的，它可以包括转录因子-靶基因调控网络和miRNA-mRNA调控网络等。
基因芯片数据挖掘分析表达差异基因
基因芯片数据挖掘分析表达差异基因基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。
基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。
当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
据此可重组出靶核酸的序列。
目前已有许多数据库，包括NCBI的GEO数据库(/geo/)，ArrayExpress数据库(/arrayexpress/)，和TCGA数据库(/)等等，记录和储存着大量芯片相关的数据，其中GEO数据库是目前最大最全的数据库，可供科研人员查询和下载相关数据。
下面和大家分享一下基因芯片数据的预处理方法。
1）分析前需要对数据进行背景信号处理：背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。
一般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的平均值作为背景，但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点。
也可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或综合整个芯片非杂交点背景所得的平均吸光值做为背景。
其中，各字母的意义如下：N：条件数；G：基因数目（一般情况下，G>>N）；行向量mi=(mi1,mi2,…,miN)表示基因i在N个条件下的表达水平（这里指绝对表达水平，亦即荧光强度值）；列向量mj=(m1j,m2j,…,mGj)表示在第j个条件下各基因的表达水平（即一张芯片的数据）；元素mij表示第基因i在第j个条件下（绝对）基因表达数据。
m可以是R（红色，Cy5，代表样品组）。
也可以是G（绿色，Cy3,代表对照组）。
2）芯片数据清理：经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，还有一些单个异常大（或小）的峰（谷）信号（随机噪声）。
利用基因芯片技术研究基因表达谱
利用基因芯片技术研究基因表达谱第一章：基因芯片技术简介基因芯片技术是目前研究基因表达谱最常用的方法之一。
该技术的原理是利用DNA杂交的特性，将研究对象的RNA转录成cDNA，并通过杂交反应与固定在芯片上的DNA探针结合，从而测定样本中的基因表达水平。
与传统基因表达研究方法相比，基因芯片技术具有高通量、高灵敏度、高复现性等优点，能够同时检测上万个基因，为基因功能研究提供了有力的工具。
第二章：基因芯片技术的主要步骤基因芯片技术主要包括实验设计、样品处理、杂交反应、图像扫描和数据分析等步骤。
1. 实验设计：在进行基因芯片实验之前，需要明确研究问题和目标，确定实验设计方案。
这包括选择适当的芯片类型、样品处理方法、实验重复次数，以及对照组和实验组的设计等。
2. 样品处理：样品处理是基因芯片实验的关键步骤之一。
在样品处理过程中，需要提取RNA并将其转录为cDNA。
此外，还需要对RNA样品进行质量检测和纯化，以确保获得可靠的杂交结果。
3. 杂交反应：杂交反应是基因芯片实验的核心步骤。
该步骤中，将标记有探针的芯片与标记有cDNA的样品进行杂交反应。
在反应过程中，cDNA与芯片上的探针发生特异性结合。
随后，通过洗涤去除未结合的cDNA，然后进行图像扫描。
4. 图像扫描：图像扫描是基因芯片实验的一项重要步骤，主要用于记录杂交反应后的结果。
利用图像扫描仪，将芯片上的探针结合信号转化为可读的图像。
5. 数据分析：数据分析是基因芯片实验后续的重要工作。
通过对扫描得到的图像进行图像分析和信号处理，可以得到反映基因表达水平的原始数据。
接下来，可以进行差异表达分析、聚类分析、功能富集分析等，进一步挖掘基因的生物学功能。
第三章：基因芯片技术的应用领域基因芯片技术广泛应用于生物学、医学和农业领域。
以下列举几个典型的应用领域：1. 癌症研究：基因芯片技术可以帮助科学家了解癌症的分子机制，发现不同类型癌症的特异性基因表达谱，为癌症的诊断和治疗提供依据。
免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法
免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法基因芯片是一种新型的生物技术工具，它被广泛运用于生物学研究、医学诊断以及农业等领域。
在免疫学研究中，基因芯片可以用来分析基因表达，研究免疫系统的生物学和病理生理学，以及开发新的免疫疗法。
本文将探讨免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法。
一、基因芯片在免疫学研究中的应用基因芯片技术基于DNA序列互补的原理，可以同时探测几千个基因在不同生理和病理条件下的表达水平。
在免疫学研究中，基因芯片技术可以用来研究免疫系统中与疾病相关的基因表达变化，为免疫治疗的开发提供重要的信息。
1. 免疫系统基因表达谱的分析免疫系统是一种复杂的网络，包括免疫细胞、激素和细胞因子等多种成分。
在不同生理和病理条件下，免疫系统中的基因表达模式会发生变化，这些变化与多种疾病的发生和发展密切相关。
利用基因芯片技术可以对免疫系统中的基因表达谱进行全面的分析，从而发现与免疫系统相关的新的治疗靶点。
2. 免疫治疗的监测免疫治疗是一种新兴的治疗模式，包括肿瘤免疫治疗、自身免疫病治疗以及感染病治疗等。
基因芯片技术可以用来监测免疫治疗的效果，并评估治疗的预后。
例如，利用基因芯片技术可以分析免疫治疗后T细胞的基因表达谱，从而预测治疗是否成功。
3. 病原体识别和分析免疫系统的主要功能是识别和清除病原体，基因芯片技术可以用来识别和分析各种病原体的基因表达模式，从而发现新的病原体治疗靶点，为针对性治疗提供依据。
二、基因芯片数据分析方法基因芯片技术可以同时测量成千上万个基因的表达水平，产生的数据量很大，数据分析也是一个复杂的过程。
一般情况下，基因芯片数据分析包括数据预处理、差异基因筛选、聚类分析、生物学意义的解释等几个步骤。
1. 数据预处理数据预处理指的是原始的基因芯片数据清洗与归一化的过程，这是数据分析的关键步骤。
数据预处理的目的是剔除芯片噪声、基准样本处理、将不同芯片数据进行标准化处理，提高数据质量和可靠性，为后续分析打下基础。
基因芯片技术在基因表达研究中的应用
基因芯片技术在基因表达研究中的应用随着现代科学技术的不断发展，基因芯片技术作为一种新兴的科学技术，引起了人们的广泛关注。
基因芯片技术是一种基于DNA 光学成像技术的高通量分析技术，能够以高效的方式同时识别和监测上千个基因，并且可以用于大规模、高通量的基因表达研究。
一、基因芯片技术的原理基因芯片技术通过特定的方法把数万个 DNA 片段置于一个非常小的芯片上，在每个 DNA 碎片的位置上附着荧光分子或其他化学分子，然后监测每个位置上分子的光信号来测量每个 DNA 片段的实时表达情况。
通过这种方法，可以大规模地研究生物体内基因的表达模式，以及这些表达模式与生物体的生理状态和疾病发生的关系。
二、基因芯片技术是一种非常有前景的新兴分析技术，可以广泛应用于生命科学领域的基因研究、基因表达分析和疾病诊断。
下面我们将重点介绍基因芯片技术在基因表达研究方面的一些应用。
1、基因表达谱分析基因芯片技术不仅可以识别和量化单个基因的表达，同时还能够同时测量并比较限定的许多基因。
这种方法的产生使学者们无需单独的克隆和筛选，也不需要对基因的序列信息有很深的了解，就可以大规模快速、全面地分析基因表达谱。
举个例子，基因芯片技术可以在一个非常短的时间内分析一组基因的表达情况，通过分析，把不同结构和功能基因的表达情况可视化，这有助于学者们理解基因和生物体之间的关系。
这一应用在生命科学领域中被广泛使用。
2、发现基因与疾病之间的关系基因芯片技术不仅可以发现表达谱在基因水平上的变化，同时还能够帮助学者们发现与某些疾病有关的基因。
基因芯片技术通过对于基因的大规模分析，可以大大缩小关键基因的范围，这对于医学研究者来说，是一个极为宝贵的资源。
3、建立生命科学数据库基因芯片技术还可以通过全面的基因识别研究，为构建生命科学数据库作出重要贡献。
基因芯片技术可以获取基因表达谱信息，用以建立相应的数据库，这有助于学者们研究生物体的生理状态、基因调控网络的建立和控制机制的研究等方面。
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杂交过程
影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素 1．核酸浓度 2．探针的类型和长度 3．碱基组成 4．杂交液成分 （1）离子强度 （2）Formamide （3）季铵盐溶液 （4）杂交加速剂 5．不匹配序列 6．杂交时间 7．杂交温度
原核生物样品
数据分析流程图
原始图象文件(Cy3/Cy5) →定位 →栅格处理(griding)→数据自动提取
• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
新一代芯片技术 光纤微珠芯片
Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays,
Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287,
标记
mRNA Reverse Transcriptase
cDNA in vitro transcription
cRNA
Fragmentation of cRNA GeneChip Hybridization
实验过程
• 样本制备 • 样本标记 • 预杂交 • 杂交 • 洗涤 • 染色（如生物素
标记） • 扫描 • 数据分析
RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只 需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他 染料；但实验误差大
标记方法
• RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体 系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物， 通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。 这种实验方法效率较低，对RNA样本需求 量大，通常要50～200μg总RNA，1～3μg mRNA
合板D成N与A启互动补子的c下RRN游NA的A。模
Fragmentation of biotinylated cRNA
芯片杂交
• 将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交 1小时左右（ cDNA和长链寡核苷酸，42度（50 ％甲酰胺）；短链寡核苷酸，50度）
• 杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内 反应14-18小时
mRNA的纯化方法
• 两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中分 离mRNA, 总RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA， 其中９０％以上是rRNA和tRNA，分离mRNA的 原理一般利用真核生物的mRNA的３’端都有 polyA尾，用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化 mRNA。
• 一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤维 素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但RNA 的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要求不高 时可采用
• 荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光 源激发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行 检测。如花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发 和发射波长分别为：550/570和649/670。大部分 扫描仪都能对这两种荧光标记进行图像处理。这 种标记方法没有同位素标记的限制；而且具有极 高的灵敏度，能够进行定量检测
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair
Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
• Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs • Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch
• 基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导 下的体外转录反应来完成线性扩增。该方 法能从1～50ng mRNA分子出发扩增出足 够数量的cDNA靶分子。这种扩增方法更具 线性
合成cDNA二链
• 在小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶的作用下， 反转录生产cDNA一链。MMLV反转录酶会在 cDNA一链的3’端加上非模板的寡聚C残基，这时 加入3’端带有寡聚G的引物，可以结合到cDNA的 3’端，生成一小段双链的cDNA，再在DNA聚合 酶的作用下延伸形成
cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光， 制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行 杂交
• 两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过 计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量， 通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中 基因表达是否有变化。
双荧光系统芯片的原理及流程图
Cy3标记的A组织mRNA
Scan
Wash & stain
样本制备
• 表达谱基因芯片研究的对象是样本中的 mRNA，抽提出的mRNA需要经过反转录 酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记， 标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。
• 基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子 生物学中传统的方法，但要求必须能够尽 可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持 实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息 之间的平行性。
• 加入RNase H，水解掉RNA模板，以残留的与 cDNA一链配对的短片段RNA为引物，在DNA聚 合酶的作用下生成双链cDNA
噬菌体T7 DNA编码的酶， 对T7启动子序列具有高
度特异性，m不能R识N别A其
它生物来源的启动子。
是依赖于DNA的RNA聚 合酶，具有5'→3'的RNA 聚合酶活性，以含有T7 启动子序列的双链DNA 为模板，以NTP为底物，
→数据入表达谱数据库
→原始数据标准化(normalization)
Ratio值分析
Cluster分析
显著性表达差异基因 具有相似表达谱基因
Experiment group/control :
信号叠加图
Hepacellular carcinoma/Normal liver
Red: 明显上调 Yellow: 差异不显著 Green: 明显下调
451-452, 2000 Decoding Randomly Ordered DNA Arrays, Kevin L. Gunderson, Genome Research,
14: 870-877, 2004.
光纤微珠芯片---技术原理
微珠
3.1 um无孔无荧光 硅珠
每个微珠单独质控
•有效的反应表面积和体积比 •低/无背景 •大小均一
逆转录：合成cDNA一链
• mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作 引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转 录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从 而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中 纯化mRNA的工作
• 总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA 进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到 逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA 的纯度
混合探针
Cy5标记的B组织mRNA
杂交
以两种波长的激光扫描 Cy3-532nm Cy5-635nm
数据分析、寻找差异表达的基因
单色荧光系统
• 较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片； 载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用， 如Illumina芯片
• 实验组和对照组分别用同样的荧光物质标 记（或生物素biotin），分别与芯片杂交， 即一张芯片 Nhomakorabea杂交一个样本
• 洗片，扫描检测 • 杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶DNA浓
度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量 成线性关系
RNA相对不稳定
Array
RNA:DNA Hybridized Array
Fragmented cRNA Target
Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]
• 根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个 片段结合，通过与对照组的比较转化成基 因表达的改变
单荧光系统芯片的原理及流程图
探针A：biotin标记
杂交
探针B：biotin标记
扫描
两张芯片上 相同位点信 号比
数据分析、寻找差异表达的基因
单通道和双通道的比较
• 单通道实验结果重复性更好，使得比较不 同样品之间各种基因表达的相对比例是可 靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的 比较时，只需在多个样本中设置对照。由 于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。
样本量
• 从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验 需要？非扩增：20微克；扩增：1微克
• 有些情况下，样本极为稀有，不可能得到 大量的mRNA靶分子
• 基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程 度上限制了该技术的推广
• 发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯 片实验样本用量
核苷酸的修饰方法
• 荧光标记：需避光，合成效率低，不同的荧光修 饰会影响标记效率，如Cy3标记的和Cy5标记的 NTP掺入到DNA和RNA链中的效率是不一样的； 最终也导致成本高
• RNA样本扩增后进行标记
扩增mRNA（cRNA）靶分子
• 联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应 来完成线性扩增。
• PCR方法： 同一用量和限制循环次数的条件下，通过RT-PCR 可平行的扩增实验组和对照组的RNA样本以满足 实验要求并同时进行荧光标记。
扩增mRNA（cRNA）靶分子
单链和双链探针
• 双链探针在液相条件下自我复性从 而大大降低与固着的靶DNA杂交 的机会，从而降低了探测灵敏度， 因此需更多的探针量。
• 单链，使杂交灵敏度提高
基因芯片实验流程及方法
cDNA microarray