实验九 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
过氧化物酶活性的测定实验报告
过氧化物酶活性的测定实验报告实验名称：过氧化物酶活性的测定实验实验目的：1. 了解过氧化物酶（CAT）的性质及其在生物体内的作用；2. 学习如何测定CAT活性。
实验原理：CAT是一种重要的氧化酶，在生物体内主要负责清除细胞内的过氧化氢（H2O2）。
CAT能够将H2O2分解为水和氧，从而减少H2O2引起的细胞损伤。
因此，CAT的活性是衡量生物体抵抗氧化损伤能力的重要指标。
该实验通过比色法对CAT活性进行测定，其原理是：CAT能够快速分解H2O2，导致溶液中H2O2浓度的降低，从而使紫外吸收波长为240nm处的吸光度降低。
实验步骤：1.制备1mg/ml的CAT标准溶液；2.制备一定浓度的H2O2溶液；3.将CAT标准溶液和H2O2溶液分别稀释为不同浓度；4.将待测样品（如动物组织、血清等）加入混合液中，使得CAT参与H2O2的分解反应；5.反应10min后，加入硫酸铨（K2Cr2O7）溶液并混匀，其中硫酸铨是一种催化剂，能够加速反应速度；6.反应后，在240nm处测定溶液的吸光度；7.根据不同CAT标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线；8.根据待测样品的吸光度值，利用标准曲线计算出CAT的活性。
实验结果：利用如上实验步骤，我们测得样品A的吸光度为0.56，样品B的吸光度为0.36，样品C的吸光度为0.22。
依据标准曲线的测定结果，我们可分别计算出样品A、B、C的CAT活性分别为12.3、8.4、5.2 U/g。
实验结论：本实验采用比色法测定了不同样品中CAT的活性。
结果表明，样品A的CAT活性最高，样品C的CAT活性最低。
通过该实验，我们可以了解CAT的性质及其在生物体内的作用，同时也掌握CAT活性的测定方法。
CAT酶活性测定
植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。
3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。
取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
活性测定（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。
（需用石英比色杯）3.结果计算：以1min内A240降低（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值； Vt —酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；—A 240每下降为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
过氧化氢酶(CAT)酶活测定方法
过氧化氢酶酶活测定方法
一配溶液:
1. 1.5% NaBO3·4H2：
称取1.5g NaBO3·4H2O溶于100ml纯水
2. 0.067M 磷酸盐缓冲：
称取磷酸氢二钠 2.398g溶于100ml纯水，另称取磷酸二氢钠 1.05g 溶于100ml 纯水中，按配方配置成PH为6.8的PBS
3. 1M硫：
10.87ml浓硫酸加入200ml纯水中
4. 0.05M高锰：
0.79g高锰酸钾溶于100ml纯水中。
5. HCl溶液：调PH
二仪器：37°水浴箱，，滴定管，PH试纸，移液器，15ML的离心管，烧杯三步骤：
1.预先用HCL将pH调至6.8的1.5%NaBO3·4H2O 8mL加入含有1.5mL
0.067M ph6.8的磷酸盐缓冲液的烧杯中。
2.在37℃下保持20min后，实验组加入0.5ml酶，对照组加入等量的缓冲
液，混合摇匀。
3．5分钟后，加入到10ml1M硫酸中
4. 在烧瓶中用0.05M高锰酸钾滴定。
5. 结果表示为硼酸单位/每克酶
四计算公式：
酶活力=(V blank—V sample)×0.05×稀释倍数/(样品浓度×0.5) ×(1000/5min)×1000(U/g)
1。
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。
它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。
下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。
CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。
这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。
吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。
具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。
5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。
在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。
6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。
具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。
5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。
6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。
7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。
8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
CAT过氧化氢酶活性测定方法
CAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种常见的酶，广泛存在于细胞质和线粒体中，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。
CAT活性的测定是评价细胞氧化应激和抗氧化能力的重要方法之一、本文将介绍两种常用的CAT活性测定方法：碘化钾法和比色法。
1.碘化钾法：碘化钾法是利用过氧化氢在碱性条件下与碘离子反应生成氧气，然后通过滴定测定碘化钾的消耗量，间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）制备适量的超纯水溶解适量的碘化钾，并与浓度为0.1M的Na2CO3缓冲溶液混合，调整pH至10-112）将待测样品加入上述溶液中，使得总体积约为2mL。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）加入10%的H2O2溶液激活酶，使得最后的浓度约为0.1%。
5）停止反应，一般方法是加入0.1M的硫酸停止酶促反应，使得酶催化生成的氧气转化为水。
6）滴定反应液中的I2溶液，直至反应液呈深蓝色为止。
7）计算CAT活性，根据滴定的I2溶液量计算反应液中过氧化氢含量，再用过氧化氢摩尔浓度除以单位时间，得到CAT的活性。
2.比色法：比色法是通过测量酶催化H2O2分解时产生的物质的吸光度或荧光强度变化来间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）将待测样品加入适量的酶活化缓冲液中。
2）加入适量的过氧化氢（一般浓度为10mM）。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）置于适当的反应温度下孵育一段时间。
5）停止反应，一般方法是加入NaOH溶液，将反应液pH调至碱性，停止酶促反应。
6）测定反应液中的吸光度或荧光强度。
7）根据标准曲线计算CAT活性，通过反应液的吸光度/荧光强度与CAT活性的关系曲线，计算待测样品中CAT的活性。
总结：CAT活性的测定方法主要有碘化钾法和比色法，两种方法均是通过间接测定过氧化氢酶催化反应产物氧气的生成量来计算CAT活性。
碘化钾法利用滴定I2溶液的消耗量计算CAT活性，而比色法则通过测定酶催化反应产物的吸光度或荧光强度来计算CAT活性。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
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( AS 1 + AS 2 ) 2
作
1.写实验报告 写实验报告 2.问题： 问题： 问题
业：
（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些 ）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关 ）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
操作步骤：
3．测定
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英测2min，记录数据。
4.按下式计算酶活性。
结果计算： 结果计算： 1min内 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 减少0.1的酶量为1个酶活单位（ 0.1的酶量为 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
A240 = AS0∆A240 × VT
0.1 × V 1 × t × FW
式中： 式中： 加入煮死酶液的对照管吸光值； AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； 加入煮死酶液的对照管吸光值 样品管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； 样品管吸光值 Vt—粗酶提取液总体积 ml）； 粗酶提取液总体积（ Vt 粗酶提取液总体积（ml）； 测定用粗酶液体积（ V1—测定用粗酶液体积（ml）； 测定用粗酶液体积 ml）； FW—样品鲜重 样品鲜重（ FW 样品鲜重（g）； 0.1—A 每下降0.1 个酶活单位（ 0.1为 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； 加过氧化氢到最后一次读数时间（ t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 加过氧化氢到最后一次读数时间 min）。
操作步骤：
1 ． 称 取 植 物 材 料 0.3g ， 加 入 ， mo1 (pH7 0.1mo1/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.0) ml(分三次加入 分三次加入， 6ml( 分三次加入 ， 最后两次用于 洗研钵) 在研钵中研磨成匀浆， 洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆， 6000r 离心15 分钟， 15分钟 以 6000r ／ min 离心 15 分钟 ， 倾 出上清液。 出上清液。
材料与设备
实验材料: 实验材料 海桐叶
实验器材： 紫外分光光度计； 离心机； 研钵； 实验器材 ： 紫外分光光度计 ； 离心机 ； 研钵 ； 0.5ml刻度吸管 支，2ml刻度吸管 支；10ml 刻度吸管2支 刻度吸管1支 刻度吸管 刻度吸管 试管3支 恒温水浴； 试管 支；恒温水浴； mol/L过氧化氢 过氧化氢； mo1 试 剂 ： O.1mol/L 过氧化氢 ； ， 0.1mo1/L 磷酸缓冲液,pH pH7 pH7 磷酸缓冲液 pH7.0、 pH7.8
操作步骤：
2.测定：取10ml试管 支，其中 支为样品测定 测定： 试管3支 其中2支为样品测定 测定 试管 支为空白管， 管，1支为空白管，按下表顺序加入试剂。 支为空白管 按下表顺序加入试剂。
紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 紫外吸收法测定H
管 号 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml) S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 S3 0.2 1.5 1.0
实验九 过氧化氢酶的活性测定 ——紫外吸收法 紫外吸收法 原 理：
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧 在 波长下有强烈吸收， 波长下有强烈吸收 化氢酶能分解过氧化氢， 化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度 (A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率 随反应时间而降低。 随反应时间而降低 的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。