【精品】微生物的分离、培养与计数
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
实验9 微生物的分离、接种和培养
实验9 微生物的分离、接种和培养一、目的与要求(一)掌握微生物各种接种分离方法。
(二)掌握无菌操作的基本环节。
(三)完成定数量的微生物接种任务。
二、原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把它们分离出来。
将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料与仪器(一)菌种大肠杆菌、枯草杆菌、金黄葡萄球菌、酵母菌、青霉菌(二)缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄额肉汤半圆体培养基试管垂直；缓冲葡有糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；寒氏培养基平板。
(三)接种环接种针，接种钩。
镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。
四、操作方法(一)接种1.接种前的准备工作(1)检查接种工具。
(2)在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期等。
(3)将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。
2.接种方法(1)试管接种方法。
①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟住;②置试管口于酒精火焰附近;③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。
④用接种工具取少许菌种置于另支试管中，按定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
⑥重新塞上棉塞。
⑦烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
(2)试管菌种接种到平板培养基的方法。
①左手持平板和试管菌种，右手松动试管棉塞，烧接种工具。
微生物的分离和活菌计数
微生物的分离和活菌计数一.实验目的:1.掌握倒平板的方法2.几种常用分离纯化微生物的基本操作技术3.学习平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理:微生物的分离与纯化的概念:从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程.活菌计数:将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
微生物分离的常用方法：（1）平板划线法：是指把杂菌样品通过平面表面划线稀释而获得单菌落的方法。
（2）涂布平板法：是指取少量梯度稀释菌悬液，至于已凝固的无菌平板培养基表面。
然后用无菌涂布玻棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，经培养后在平板培养基表面会形成多个独立的单菌落，然后挑典型的代表接至斜面，培养。
三.实验器材:1.材料：土壤2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3.仪器或其他用具：无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱四.实验步骤：（一）取样：取表层以下5—10cm初的土样，放入灭菌袋中待用，或放入4摄氏度的冰箱中保存。
（二）倒平板（无菌操作）：1.培养基加热溶化，待冷至55-60℃2.倒入培养基于无菌培养皿中（三）制备土壤稀释液（无菌操作）：1.制备土壤悬液：用台称称取5g土加盛有45ml无菌水的锥形瓶中振摇约20min,使土壤与水充分混匀。
2.梯度稀释：用微量移液器取1ml土壤悬液于盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。
（四）平板分离单菌落（无菌操作）：1.平板划线法：取4个装有已凝固的无菌牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿，在每个培养皿底用记号笔分成4个不同面积的区域，使A<B<C<D,且各区的夹角约为120度，划线时先划A 区，用左手持皿底于酒精灯旁，并将皿盖开启一缝，右手持沾有10-1的细菌悬液的接种环。
高中生物13总复习：微生物的培养、分离、计数专题-知识讲解——微生物的培养、分离、计数专题
高考总复习微生物的培养、分离、计数专题编稿：宋辰霞审稿：闫敏敏【考纲要求】1．简述微生物的培养过程，并总结其中的重要注意事项2．说明微生物培养基的特点及种类3．概述微生物的分离方法4. 概述微生物的计数方法及注意事项【考点梳理】考点一、微生物的培养条件微生物是形态微小，结构简单，需借助显微镜才能观察到的一类生物，包括细菌和蓝藻等原核生物、酵母菌和霉菌等真菌、病毒等。
本专题主要讲解关于“细菌”培养的内容。
1. 微生物培养所需要的营养物质（由培养基提供）来提供，一般培养真菌需将培养基调至酸性，培养细菌需调至中性或微碱性，培养厌氧微生物则要提供无氧条件。
2. 培养基的种类微生物的分离、鉴定、活菌计数、保存菌种观察微生物的运动；进行微生物的分类、鉴定3.无菌技术（1）在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，其主要技术是无菌操作。
主要包括以下几方面：①对实验操作的空间，操作者的手和衣着，进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近或接种箱内进行。
④应避免已经灭菌处理的材料用具与周围其他物品相接触。
⑤进行接种等操作时，培养皿盖不应全揭开。
（2）消毒和灭菌的比较【高清课堂：微生物的培养、分离、计数专题411406微生物培养的基本程序】考点二、微生物培养的基本流程注意：使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃。
【高清课堂：微生物的培养、分离、计数专题411406分离微生物纯种的方法】考点三、微生物的分离纯化1.利用特殊的接种方法分离纯种：平板划线法、稀释涂布平板法（1）平板划线法：原理：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上进行连续划线，在划线的过程中，菌体数量逐渐减少，菌体间的距离增大，距离足够大时，经培养，在划线末端处便可观察到由一个菌体繁殖产生的单菌落，挑取单菌落后继续培养，得到的便是纯种。
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数关键词：微生物分离纯化计数实验原理稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。
为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。
其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。
本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。
分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。
分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。
在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
实验七微生物的分离纯化与平板菌落计数一培养基的配制和灭菌
各组需要配置的培养基和需要灭 菌的玻璃器皿
1,干热灭菌
培养皿10付(1罐),1ml吸管6支至烘箱中进行 干热灭菌(1600C 2h);
2,制备培养基
(1) 每组制备普通营养琼脂培养基,每组 400ml分装于10支试管(灭菌后摆斜面)及2个 锥形瓶;
(2) 每组制备EMB培养基,每组400ml装于2 个锥形瓶,另10支9ml试管自来水(用10ml移 液管准确量取）
一、目的要求
1.了解培养基配制原理，掌握其制备过 程。
2．了解高压蒸汽灭菌器的原理，掌握使 用方法。
二、基本原理
1,培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产
物所需要的营养基质。 其中含有碳源、氮源、能源,无机盐、生长因子以及水分。 微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内
2.溶化：在量杯中加入所需水量（一般用自来水，特殊需 用蒸馏水），搅匀，加热溶解。
3.补水:按配方定容至所需体积。
4.调pH值：用pH试纸测pH，并用1mol/L NaOH或 1mol/L HCl调节至所需pH范围.
5.过滤：一般不过滤，特殊情况下需过滤，可用滤纸，纱 布或脱脂棉等。
6.分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装 入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。棉塞 的总长度的3/5应在口内，2/5口外。注意不要使培 养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。
（1）液体：分装高度以试管度的1/4左右
（2）固体：分装试管，其量为管高的1/5，灭菌后 制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积 之一半为宜。
（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜， 灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。
7.灭菌
培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸， 便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进 行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。
微生物检验的基本内容
微生物检验的基本内容微生物检验是一种通过对样本中的微生物进行分离、培养和鉴定的方法，用于检测和确认样本中是否存在微生物，并确定其种类和数量。
微生物检验在医学、食品安全、环境保护等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍微生物检验的基本内容，包括样本采集、分离培养、鉴定和计数等步骤。
一、样本采集微生物检验的第一步是采集样本。
样本可以是各种物质，如食品、水、空气、土壤、人体组织和体液等。
采集样本时需要注意保持样本的无菌状态，避免外界的污染。
常用的采样方法包括直接刮取、吸取、冲洗和切割等。
二、分离培养分离培养是微生物检验的核心步骤，目的是将样本中的微生物分离出来，并使其在培养基上生长成单独的菌落。
分离培养可以采用液体培养和固体培养两种方法。
液体培养适用于检测微生物总数和特定菌群的数量，而固体培养适用于分离和鉴定不同种类的微生物。
分离培养的关键是选择适当的培养基和培养条件。
培养基应包含必需的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和水分等，以满足微生物生长的需要。
培养条件包括温度、pH值、氧气浓度和湿度等，不同微生物对这些条件的要求各不相同。
因此，在进行分离培养时需要根据待检测微生物的特性来选择适当的培养基和培养条件。
三、鉴定鉴定是确定分离出的微生物种类的过程。
鉴定微生物可以从形态学、生理生化特性、生长习性和分子生物学等方面进行。
形态学鉴定是通过观察微生物的形状、大小、颜色和结构等特征来判断其种类。
生理生化特性鉴定是通过检测微生物对不同营养物质的利用、产物的生成和酶的活性等来判断其代谢特征。
生长习性鉴定是通过观察微生物的生长速度、温度范围和耐受性等来判断其生态特征。
分子生物学鉴定是通过检测微生物的DNA或RNA序列来判断其遗传关系和亲缘关系。
鉴定微生物的方法有很多种，如显微镜观察、生化试验、培养基特性和PCR等。
根据待鉴定微生物的特点和需要，可以选择适当的方法进行鉴定。
鉴定的结果应与已知的微生物参考库进行对比，以确定待鉴定微生物的种类和名称。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
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【精品】微生物的分离、培养与计数
微生物是一类非常微小的生物体，它们在自然界中广泛分布。
它们既能在有机物中繁
殖生长，又能利用无机物产生生物化学反应。
因此，微生物对于生态系统的生物转化和元
素缓冲都有重要的作用。
对于微生物的分离与培养，目前有许多方法，本文将介绍其中比
较常用的几种方法。
一、分离方法
1. 稀释法
稀释法是微生物分离中最基本的方法之一。
它的原理是将微生物溶液稀释到一定程度，然后在培养基表面或培养液中进行培养，使微生物单独分散生长。
稀释法分为限量和非限
量两种。
限量稀释方法一般用于微生物数量较少时，非限量稀释方法用于微生物数量较多时。
稀释法的优点是简单易行，适用于各种微生物。
2. 均质法
均质法是利用机械或化学方法将微生物样品分散均匀，再用无菌铁筒将分散液加压强
制穿过小孔的方法从而达到单菌分离的方法。
此方法适用于样品微生物量极少，且可用于
多种不同菌种的分离。
3. 筛选法
筛选法是通过不同的生理特性采用选择性培养基进行筛选，将目标微生物与其他微生
物分开的方法。
常用的选择性培养基有青霉素和红值耐药素互补剂选择性培养基、大肠菌
属选择性培养基等。
二、培养方法
1. 常规培养法
常规培养法是指最常见的培养方法，即将单菌接种于培养基上，使其在适宜的温度、ph值和营养成分下繁殖生长。
常用温度为30℃-37℃，ph值为7.0-7.5，营养成分包括碳源、氮源、微量元素和水等。
常规培养法简单易行，易于操作，适用于多数菌种。
原位培养法是将微生物直接培养在其生长环境中的方法，常常用于难培养的微生物，
如土壤和水样中的微生物。
原位培养法优点是能够筛选到多种不同菌种，但需要时间较
长且操作难度较高。
3. 微生物选育基培养法
微生物选育基培养法是利用各种选育基，促进菌落分化，从而达到不同菌株、菌类或
产物的选育的方法。
微生物选育基培养法的优点是快速、准确、可靠，但其缺点是培养基
较复杂，操作相对费时。
三、计数方法
1. 直接计数法
直接计数法是指在一定容积中直接计数目标微生物的数量。
常用的方法有显微镜计数法、流式细胞术计数法等。
直接计数法能够快速准确地得出微生物的数量，但是需要过滤、稀释和染色等步骤，误差较大，操作难度较大。
间接计数法是指通过微生物在培养基中的生长繁殖，推算出微生物数量的方法。
常用
的方法有营养计数法、浑浊度计数法、氧化还原电位计数法等。
间接计数法适用于少量微
生物的计数，但也有误差较大的缺陷。
综上所述，微生物的分离、培养与计数是微生物学的重要基础，也是细菌学、病毒学
等学科的前提。
通过熟练掌握分离、培养与计数方法，可以更加准确地进行微生物学研究，从而推动生物科学的发展。