土壤微生物分离与纯化实验原理和方法
环境中微生物的检测和分离纯化
环境中微生物的检测和分离纯化一、实验目的：1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。
2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。
3.用平板划线法和稀释法分离微生物。
4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。
二、实验原理：（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。
常用的是平板分离法。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。
再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。
（二）平板菌落计数法：平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。
此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。
三、实验材料和仪器：土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。
取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
四、实验步骤：（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏2g蛋白胨4gNaCl 2g蒸馏水400mL琼脂8g1. 称量：按上述配方称量各类物质。
实验五土壤中细菌纯种分离和培养
（二）培养
将前面制作的平板倒置于培养箱， 30℃培养24～48h，然后观察结果。
（三）挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌 落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此 菌落采取稀释平板法或划线分离法分离， 直至获得纯培养。
分离平板
五、注意事项
制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀 分散在稀释液中。
♫将培养皿平放在桌上， 顺时针和反时针来回转 动培养皿，使培养基和 菌液充分混匀，冷凝后 即成平板（每组制培养 皿3套）。
③对 照 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待
凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。
2、平板划线分离法
（1）平板的制作
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平 板。
1、稀释平板分离法
（1）取样 选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm 深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌 的袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实 验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
◆ 将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按 10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。
（2）划线
用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指 和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手 拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环 伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组 做三皿）。
注意：切勿划破培养基
划线的方式可取图中任何一种
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
注意：在土壤稀释过程中，吸取不 同梯度的菌液需换用不同的吸管。
（3）平板的制作 ①吸取菌液：பைடு நூலகம்
用无菌移液管吸取菌 液于无菌培养皿内。
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
实验八、土壤微生物的分离和 纯化
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
实验二土壤微生物的分离鉴定
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5、初步鉴定 对菌体进行革兰氏染色观察，记录结果。
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注意事项
1. 制备土壤稀释液时，要注意应使土样均匀分散在稀释液中。 2. 2. 无菌操作。
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实验思考
1. 在平板划线法中，为何每次都需将接种环上的残余物烧掉？ 2. 为什么要涂布后的平板要先正放一段时间后再倒置培养？ 3. 怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？
的含待分离微生物的菌液，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培 养基上，共有9个培养基平板，标号，37℃温箱培养24~48 h。
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4. 划线分离（划线培养） 对土壤稀释溶液微生物的培养基平板进行观察，记录区分明显
的细菌特征。挑取此细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养 3个培养皿），标号，37°C温箱培养。
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（二） 土样
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实验步骤
1. 配制培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
3g 10g 5g 15～20g 1000ml
调节pH 至7.2～7.4
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2）121℃灭菌2释液 称取10g土样，放入盛有90ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个 细胞繁 殖形成的。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养的 微生物。获得单个菌落的途径可通过稀释涂布平板或平板划 线等方法来完成。
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实验器材
（一）
牛肉膏，蛋白胨， NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl； 三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，试管，离心管（50ml）培养皿， 电子天平，高压蒸汽灭菌锅，无菌操作台，恒温培养箱，移液 枪（枪头），pH试纸（pH 6.4~8.0）。
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1.了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2.掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中,土壤是微生物生活中的最适宜的环境,土壤中存在大量的微生物,但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,因此,为了研究某一微生物的特性,或者要大量地培养和利用某种微生物,必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2.盛有100毫升无菌水的三角瓶,9毫升无菌水的试管,无菌吸管,无菌玻璃涂抹棒,10%的酚液,25%的乳酸,土样,接种环,标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1.制备土壤稀释液称取土样10克,放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中,振摇15—20分钟,使土与水充分混合,将菌分散,静止片刻,用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中,吹吸三次,并振摇使之充分混匀,然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中,以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基,高氏1号培养基,马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时,在高氏l号培养基中加入10%酚2滴,在马铃薯蔗糖培养基中加入25%乳酸2滴,然后分别倒平板,每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管,左手拨出棉花塞,试管口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿在火焰附近打开少许,迅速注入培养基,加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布,平放在桌面上,待凝后即成平板。
(见图18)。
3.涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度,然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液,每一平板注入0.2毫升,再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,静止5分钟。
微生物大实验 土壤中固氮微生物的分离与纯化
土壤中固氮微生物的分离与纯化一、实验目的1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习微生物纯系分离、培养方法。
3、掌握划线分离纯化微生物的方法。
4、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定5、了解该菌种的生物学特征。
二、实验原理农业生产不仅要求高产、稳产，而且要求品质优良。
长期以来，为确保农产品高产丰收，人们大量使用化学农药化肥，使得生态环境每况愈下，十分不利于农业可持续发展。
生物肥料由于具有增加土壤生物多样性、改善农产品品质、能自我更新增殖和永续利用的特性，其发展备受关注。
微生物肥料是指应用于植物或土壤环境中有生物活性，起肥料效用、或以肥料方法施用的，以微生物活性生物体或其代谢产物为主要作用因子的生物制剂或肥料制品[1]。
固氮菌可将空气中N2还原为可被作物吸收利用的NH4+，由于共生固氮菌具有宿主专一性，所以应用范围窄，而自生固氮菌不受这些因素限制，固氮能力较强，还能产生吲哚乙酸等植物激素，刺激植物生长，促进增产，其生产和使用很方便[3]。
因此，试验将从农田土壤中分离得到自生固氮菌，为研究开发新型生物氮肥提供理论依据。
通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。
涂布分离细菌的平板，温箱培养1d～2d后，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。
根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。
然后根据伯杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。
三、实验材料1．土样浙江理工大学百果园土壤2．培养基阿须贝培养基：葡萄糖10g，KH2PO4 0.2g，CaSO4 0.2g，NaCl 0.2g ，CaCO3 0.2g，MgSO40.2g ，1000mL水，pH 7.2无氮培养基：3．实验仪器超净工作台、恒温培养箱、微量移液枪、冰箱、电子天平、显微镜、酒精灯、试管、培养皿、锥形瓶、糖瓷杯、玻璃棒、接种环、棉塞、标签、打火机、酒精棉球、试管架、照相机等。
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土壤微生物分离与纯化实验原理和方法
一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计
数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平
板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，
一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两
种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个
平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边
上面各有一个计数区（图 21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数
区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个
小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1
/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的
体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1 /4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换
算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小
方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系
数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、
计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），
以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的
沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液
体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流
出的多余菌悬液。
也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数
区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计
数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折
光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、
左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大
方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的
菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线
不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个
菌体计算。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则
应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每
ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬
物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。