综合实验 土壤微生物的分离与计数
土壤微生物的分离与平板菌落计数
土壤微生物的分离与平板菌落计数实验二土壤微生物的分离与平板菌落计数一、实验目的(1)几种常用分离纯化微生物的基本操作技术(2)掌握倒平板(3)学习平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。
分离纯化微生物的常用方法有平板表面画线法、平板表面涂布法和琼脂培养基浇注法等，因为其方法简单、设备简单、分离效果好，所以一直被实验室普遍选用。
活菌计数的基本方法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
三.实验器材1.材料:土壤2.培养基:牛肉膏蛋白胨培养基3.仪器或其他用具:无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱四.实验步骤(一)采样取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 ?冰箱中暂存。
(二)倒平板(无菌操作)培养基加热溶化，待冷至55-60? ，然后在无菌操作条件下倒入培养基于无菌培养皿中，并在各培养皿上作好标记。
(三)制备土壤稀释液(无菌操作)1.制备土壤悬液用电子天平称取 5g土于装有45ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min,使土壤与水充分混匀2.梯度稀释取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。
(四)平板分离单菌落(无菌操作)选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌的土壤悬液，在酒精灯旁进行划线操作，用左手控制培养皿，右手捏接种环，在标记处划3-4条连续的平行线作当作初步稀释的菌源。
烧去接种环上的残余菌样。
将烧去残余菌样后的接种环在平板培养基边缘冷却以下，然后将培养基另一区转至划线位置，将接种环通过菌源区而移至现在的划线区，依次类推划上几次。
土壤稀释法实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解土壤稀释法的原理和应用。
2. 掌握土壤稀释法的实验操作步骤。
3. 通过实验，学习如何分离和计数土壤中的微生物。
4. 分析土壤微生物的种类和数量。
二、实验原理土壤稀释法是一种常用的微生物分离和计数方法。
该方法的原理是将土壤样品进行一系列倍比稀释，然后涂布于培养基表面，经过培养后，土壤中的单个微生物细胞或孢子在培养基上形成菌落，从而可以分离和计数微生物。
三、实验材料1. 土壤样品：采集自实验基地，新鲜、无污染。
2. 营养琼脂培养基：用于培养微生物。
3. 稀释液：无菌水或生理盐水。
4. 移液器：用于准确吸取稀释液。
5. 平板计数器：用于计数菌落。
6. 灭菌器械：酒精灯、无菌操作台、镊子等。
四、实验步骤1. 样品处理：取土壤样品10g，加入90mL无菌水，充分振荡混匀，制成土壤悬液。
2. 稀释：取1mL土壤悬液加入9mL无菌水中，制成10^-1稀释液；取1mL10^-1稀释液加入9mL无菌水中，制成10^-2稀释液；以此类推，制成10^-3、10^-4、10^-5稀释液。
3. 涂布：取10^-3、10^-4、10^-5稀释液各0.1mL，分别涂布于三个营养琼脂培养基平板上。
4. 培养与观察：将涂布好的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 计数：用平板计数器计数每个平板上的菌落数，记录结果。
6. 结果分析：根据菌落数，计算土壤样品中的微生物数量。
五、实验结果与分析1. 实验结果经过24小时培养，三个平板上的菌落数分别为：A平板30个，B平板50个，C平板80个。
2. 结果分析根据实验结果，土壤样品中的微生物数量约为30×10^4个/g。
六、实验讨论1. 实验过程中，土壤悬液的制备和稀释操作要尽量减少污染，确保实验结果的准确性。
2. 在涂布过程中，要确保稀释液均匀涂布于培养基表面，避免菌落聚集。
3. 培养过程中，要注意温度、湿度等条件，确保菌落正常生长。
实验四 土壤微生物的分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基； 高氏1号培养基； 马铃薯葡萄糖培养基（添加有抗生素）；
灭菌水、移液器、吸头、接种针、涂布器、灭 菌离心管、消毒酒精、试管架、记号笔、吸水 纸、酒精灯、平皿、漩涡振荡器、天平等。
实验内容
土壤微生物的分离和纯化 系列稀释法 划线法（讲解） 分离微生物的形态观察 （3天后） 细菌 放线菌 真菌
记录系列稀释法分离土壤微生物的结果：
真菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 细菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 放线菌菌落的种类和数量，菌落特征描述；
通过试验和查阅资料，独立完成思考题。 实验中出现问题的分析和讨论。
3天后观察记录分离试验结果，上交实验报告。
思考题：
在分离真菌时，有哪些方法可以避免或减少 细菌的污染？
称取土壤样品0.5~1.0 g加入含30ml灭菌水的塑料离心管 中振荡3～5分钟（旋涡振荡器），形成土壤悬浊液； 取0.1ml加入装有0.9ml灭菌水试管中，振荡均匀。依次稀 释，共5次。 细菌的分离：取第3，4，5 ，6四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养平板上； 放线菌的分离：取第1，2，3 ，4四个稀释水平的样品分 别取0.1ml，均匀涂布在高氏1号培养基； 真菌的分离：取第2，3，4 ，5四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在含抗生素的PDA平板上； 菌液被培养基吸收后，反转放置，做好标记，28℃培养。
细菌菌落的共同特征
湿润 粘稠 质地均匀 较透明 易挑取（与培养基结合不紧密） 菌落正、反面、边缘、中心颜色一致
注意事项：
实验五土壤微生物分离
Microbiology
3．制备稀释液(无菌操作 ．制备稀释液 无菌操作 无菌操作)
(1)制备土壤悬液： 制备土壤悬液： 制备土壤悬液 称土样0.5g，迅速倒入 无菌水瓶中， 称土样 ，迅速倒入49.5mL无菌水瓶中，振荡 无菌水瓶中 5～10min，使土样充分打散，即成为 -2的土壤悬 ～ ，使土样充分打散，即成为10 液。 (2)稀释： 稀释： 稀释 无菌移液器吸10 的土壤悬液1.0mL，放入 用1mL无菌移液器吸 -2的土壤悬液 无菌移液器吸 ， 9.0mL无菌水中即为 -3稀释液，如此重复，可依 无菌水中即为10 稀释液，如此重复， 无菌水中即为 次制成10 的稀释液。注意： 次制成 -3～10-8的稀释液。注意：操作时每一个 稀释度换用一支移液器枪头，以减少稀释中的误差。 稀释度换用一支移液器枪头，以减少稀释中的误差。
Microbiology
4. 涂布法测定菌落数
(1) 细菌 用一支新的无菌枪头， 两管稀释液各200ul， 用一支新的无菌枪头，取10-7、10-6两管稀释液各 、 两管稀释液各 ， 分别接入LB培养基平板上 培养基平板上， 分别接入 培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒 涂匀。 涂匀。 （2）放线菌 ） 取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入酚液3～5滴，摇 、 两管稀释液，在每管中加入酚液 ～ 滴 两管稀释液 从中各取200ul，分别接入高氏一号培养基平板上，用 匀，从中各取 ，分别接入高氏一号培养基平板上， 灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。 灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。 （3）霉菌 ） 两管稀释液， 取10-2、10-3两管稀释液，在每管中加入乳酸 ～5滴，摇 、 两管稀释液 在每管中加入乳酸3～ 滴 从中各取200ul ，分别接入马铃薯蔗糖培养基平板上， 分别接入马铃薯蔗糖培养基平板上， 匀，从中各取 用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。 用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
3.78 ×104 2.71 ×104
5.13 ×105 2.70 ×102 采用科学计数 法；取两位小 数
６
无法计数
305
12
－
3.05 ×104
“无法计数”——指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数， “0”——指平板上无微生物菌落生长。
五、作业
1、将每一个稀释度的三个平板上的菌落数填入下表，并计算结果
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
三、实验材料
1、牛肉膏蛋白胨培养基、土壤样品、无菌 水 2、培养皿、玻璃试管、胶头滴管、涂布棒
四、实验步骤
1、细菌的分离纯化——稀释涂布平板法
（1）试管和培养皿编号 在试管壁上依次标上10-2、 10-3、10-4、 10-5、10-6。在培养皿养皿的底部依次标上10-4-1、 10-4-2 、 10-5-1 10-5-2 、10-6-1、 10-6-2。 （2）倒平板 将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化（微波炉加热3min5min），待培养基冷却至不烫手时（约50℃），无菌倒入已编号的 培养皿中，室温凝固，备用。 （3）土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶 中，震荡15-20min，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。用胶 头滴管移取1 mL菌悬液至标有10-2的离心管中，震荡混匀，制成102的菌悬液；从10-2管中取1 mL菌悬液至标有10-3的离心管中，震荡 混匀，制成10-3的菌悬液；同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。
【精品】实验四 土壤微生物的分离和计数
【精品】实验四土壤微生物的分离和计数实验目的：1.掌握土壤微生物的分离方法。
2.利用平板计数法和涂布法等方法进行土壤微生物的计数。
实验原理：1.微生物分离法微生物分离法是将微生物从混合物或样品中分离出来的方法，是微生物学中最常用的一种基本方法。
常用的方法有稀释平板法、涂布法等。
2.平板计数法平板计数法又称菌落计数法，是通过数目测定评估微生物数量的方法。
通常在固体培养基上用微生物悬液接种，培养出菌落，以评估菌群密度。
计算微生物数量时应选择符合菌落特征的一个菌落，如颜色、密度、大小等，并使用总体积、稀释因子及加样体积计算。
3.涂布法涂布法又称涂布分离法，是一种快速、容易、简单、实用的微生物分离和计数方法。
方法是取少量样品加入到无菌的琼脂培养基中，将琼脂培养基均匀地涂布在培养皿中，然后在恰当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，最后计算菌落单位体积的数量。
实验材料和设备：1.土壤样品；化学试剂：蒸馏水、1%碳酸氢钠溶液、1%双氧水溶液、1.5%琼脂等。
2.培养皿；吸管；移液管；吸胶头；灭菌器；微量注射器等。
实验步骤：1.准备样品：取土壤样品，干燥，粉碎，筛选出粒径较小的部分备用。
2.制备0.1g/ml的悬液：取粉碎好的土壤样品0.1克，加入到10ml的蒸馏水中，用吸管吸取混合后的液体，摇匀后待沉淀，取稠泥状上清液，稀释成0.1g/ml的土壤悬液。
3.平板法计数：取一定体积的土壤悬液接种在称量好的琼脂平板上，进行涂布，涂布均匀后，放置在恰当的温度下，培养约24小时，以单个菌落的数量（单位：cfu/ml）计数，并使用公式计算微生物数量。
4.涂布法计数：用吸管吸取一定体积的土壤悬浊液，加入到10ml的液体琼脂培养基中，均匀地涂布在培养皿中，在适当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，然后计算菌落单位体积的数量。
实验记录和数据处理：1.记录实验过程、结果和分析。
2.计算平板菌落数量和涂布法菌落数量。
3.对实验结果进行分析比较，得出结论。
实验(二)土壤中微生物的分离纯化及观察
2.稀释:
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
原样
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0.2ml
0.2ml
0.2ml
3.取样
10-4
10-5
10-6
4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml， 置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
么？
当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在
一起时，你认为问题出在哪里？
用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不
同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
倾注法
涂布法
倒平板
a 皿加法
b手持法
细 菌Leabharlann 霉菌放线菌实验内容
一、稀释涂布平板法（全组完成）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 ：涂布10-3、10-4、10-5三个剃度，每个剃度两 块平板 高氏Ⅰ号培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板 马丁氏（孟加拉红）培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度 两块平板
器材
分离源：自采集土壤样品
培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号 培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基 溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌 吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。
一、稀释涂布平板法（全组完成）
1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次 标明10-2、10－3、10-4、10-5。
0.5ml
各4.5ml 无菌水
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包扎好
160℃ 干热灭菌2h（写好组别）
90ml无菌水+玻璃珠-----三角瓶1个
4.5ml无菌水------ 7ml离心管5支
需要提前准备的东西
线绳、报纸、纯净水、培养基药品、7ml离心管、50ml
离心管， 1ml枪尖，枪尖盒，刮刀，平皿，电磁炉及锅， 玻璃珠，pH试纸，氢氧化钠，三角瓶、三角瓶胶塞、记 号笔，灭菌锅，培养箱，电子称，小框，火柴，显微镜， 染色液，24孔板
9、10、11、12组---1500ml分装8瓶 （每瓶3.2g琼脂）
“”
倒平板
注意事项
培养基中药品数量要根据需要计算、称量 培养基的成分如有必要可加热溶解 先加一半的水，加热溶解药品后，再加另一半水 调节pH值后加琼脂 高氏一号培养基的“淀粉”换为“蔗糖” 灭菌时注意排空空气，25分钟，降压后开锅
二、实验原理
土壤中微生物大约108个/克，
通过一系列微生物技术
达到分离、计数土壤微生物。
三、实验材料
学生采集的校园土样，每组10克
四、实验内容：分为三个 五、实验报告
内容1：培养基的制备及灭菌
（1）灭菌所用玻璃器皿
（2）配制所用的两种培养基
（3）培养基灭菌及倒平板
（1） 灭菌所用玻璃器皿
每组： 10支枪头及移液器
灭 菌
90ml纯净水含玻璃珠的三角瓶每组一个，不灭菌
1ml移液器，每2组一支 5ml移液器，每桌一支
（2）配制所用的两种固体培养基
全班分工协作使得应每组得到：
0.5瓶
0.5瓶
牛肉膏蛋白胨固体培养基 （倾注）
牛肉膏蛋白胨固体培养基 （涂布）
0.5瓶
高氏一号固体培养基
牛肉膏蛋白胨培养基： 1、2、3、4组---1800ml， 分装8个三角瓶 每瓶200ml， 营养琼脂每瓶补0.8g琼脂，
实验七、八、九 综合大实验
土壤微生物的分离、培养、观 察和计数
内容1：培养基的制备及灭菌 内容2：土壤微生物的分离 内容3：分离微生物的形态观察、 菌落计数
一、实验目的 掌握微生物培养基的制备及灭菌技术 掌握土壤中微生物分离纯化常用的三种方法 掌握微生物的无菌操作技术 掌握微生物的接种技术 掌握土壤微生物的菌落计数技术
3、微生物的划线分离
显微镜观察3种菌，记录形态特征
0.2ml
牛肉膏培养基
0.2 1 0.2
0.2 1
0.2 1
表面涂布法
倾注法
1ml 0.2 0.2
高氏一号 培养基
用刮刀由稀向浓涂布
注意事项
注意无菌操作
注意倾注法倒平板的“火候”
刮刀从低浓度-----高浓度
划线时注意烧针
内容3：分离微生物的形态观察、 菌落计数
（1）平皿菌落数：30—300个有效 平皿中都有效取平均 计算每克土壤的含菌量 （2）单染色观察5-10个菌的个体形态
内容2：土壤微生物的分离
1、无菌操作稀释土样 10-1（三角瓶） 取0.5ml以次稀释 三角瓶-10-2---10-3-------10-4-------10-5---------10-6
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
内容2：土壤微生物的分离
2、无菌操作稀释分离
试管---10-3---- 10-4--- 10-5-----10-6----10-7
250ml三角瓶，平均每组3个： 一个放水含玻璃珠90ml， 一个放牛肉膏200ml， 一个放（两个组一瓶）高氏1号，
还有每桌一瓶（200ml纯净水）
刮刀2个， 包扎， ， 平皿14个，包扎
1ml枪尖 ， 每桌一盒 200ml纯净水 ，每桌一瓶
第一天准备
50ml离心管每组一支 7ml离心管每组7支，包扎 5ml枪尖，每组一支
5、6、7、8组--- 1800ml，分装8个三角瓶
每瓶200ml， 营养琼脂每瓶补0.8g琼脂， 牛肉膏 5克, 氯化钠5克， 蛋白胨10克， pH7.2—7.4 水1000ml 琼脂，18
营养琼脂配方（记着换算）：
高氏一号培养基（记着换算）： 蔗糖 20g KNO3 1g K2HPO4 0.5g NaCL 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4 0.01g 水1000ml pH7.2-7.4 琼脂18