高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
高产漆酶菌株的筛选是指在自然环境中寻找出能够高效产生漆酶的菌株。
常规的筛选方法包括培养物染色法、营养物变质法、纸板涂片法等。
其中，培养物染色法是最常见的筛选方法，通过将待筛选菌株培养在含有染料的培养基上，观察染色变化来筛选出具有高产漆酶能力的菌株。
营养物变质法则是通过使用染料作为唯一碳源进行培养，筛选出能够利用染料作为唯一碳源并高效降解染料的菌株。
纸板涂片法是通过将待筛选菌株涂片于含有染料的纸板上，观察菌落生长和染料降解情况来筛选高产漆酶菌株。
高产漆酶菌株对染料的降解是指这些菌株能够将染料分子降解为无害的物质或将其转化为可再利用的物质。
漆酶是一种特殊的氧化酶，具有广谱的染料降解能力。
菌株通过产生漆酶来降解染料，漆酶可以在染料分子中引入氧原子，使得染料分子发生氧化反应，降解为低分子化合物。
高产漆酶菌株对染料的降解能力通常会通过测定漆酶活性、测定染料降解率等指标来评估。
降解染料可以有效地减少染料对环境的污染，这对环境保护和可持续发展具有重要意义。
漆酶高产菌株的筛选
参考文献 ：
［ ］ １ Ｅ Ｇ Ｇ Ｅ Ｒ Ｔ Ｃ， Ｔ ＥＭＰ Ｕ， Ｅ Ｒ Ｉ Ｋ Ｓ Ｓ ＯＮ Ｋ． Ｌ ａ ｃ ｃ ａ ｓ ｅ ｉ ｓ ｅ ｓ ｓ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｆ ｏ ｒ ｌ ｉ ｎ ｉ ｎ ｂ ｔ ｈ ｅ ｗ ｈ ｉ ｔ ｅ －ｒ ｏ ｔ ｆ ｕ ｎ ｕ ｓ ｃ ｉ ｎ ｎ ａ ｂ ａ ｉ ｎ ｃ ｎ ｏ ｏ ｒ ｕ ｓ － ｇ ｙ ｇ ｐ ｙ ｐ ［ ］ ， （ ） ： ａ ｕ ｓ Ｊ ． Ｆ Ｅ Ｂ Ｓ ｌ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ １ ９ ９ ７， ４ ０ ７ １ ８ ９－９ ２． ［ ］ ２ Ｃ Ｅ Ｃ Ｉ Ｌ Ｅ Ｓ， Ｓ Ｕ Ｓ ＡＮＡ Ｃ， Ｔ Ｅ Ｒ Ｅ Ｓ Ａ Ｖ， ｅ ｔ ａ ｌ ． Ｃ ｏ ｍ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｆ ｕ ｎ ａ ｌ ｅ ｎ ｚ ｍ ｅ ｓ ｆ ｏ ｒ ｂ ｌ ｅ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｈ ｉ ｈ－ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ａ ｅ ｒ ｐ ｇ ｙ ｇ ｇ ｙ ｐ ｐ ［ ］ ， （ ） ： ｕ ｌ ｓ Ｊ ． Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ － ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ２ ０ ０ ５， １ １ ５ ４ ３ ３ ３－３ ４ ３． ｐ ｐ ｇ ｙ ［ ］ ］ （ ） ： 高玉千 ， 高方 ， 张世敏 ， 等． 黑木耳漆酶高产菌株的筛选 ［ 中国农学通报 ， ３ Ｊ ． ２ ０ ０ ９， ２ ５ ２ １ ３ ０ １－３ ０ ４．
２． ２ 复筛结果
通过初筛 ， 我们选取 １ 将１ 从第 ５ｄ 开始 ， 每 天测 ８ 株菌株进入复筛 ． ８ 株复筛菌株接入复筛培养基中 ， 量各菌株的漆酶酶活 ， 各菌株产酶历程如图 １， 图 ２．
图 １ １ ０ 株白腐菌产酶历程 图 ２ ８ 株食用菌产漆历程
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
漆酶高产菌研究进展及应用
（ ．华 南 理工 大学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ，广 东 广 州 ５０ ４ ；２ １ １６０ ．华 南 理 工 大 学 纸 浆 造 纸 工 程 国 家 重 点 实 验 室 ， 广 东 广 州 ５ ０４ ） １６ ０
摘 要 ：综 述 了漆 酶 高产 茵 的研 究 现 状 ，提 出 了今 后 漆 酶 高产 菌的 研 究 方 向 ，同 时 也 对 漆 酶 在 环 境 保 护 、 生物 检
测和电化 学分析、造纸工业、食品工业和智能包装等方 面的应用价值进行 了概述 。
关键 词 ：漆 酶 ；高 产 茵 ；研 究进展 ；应 用 中图 分类 号 ：Ｑ ５ ５ 文 献标 识 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１０ ・６ １ （ ０８ １－１８０ ０ ８１３ ２０ ） ０ ５ － ０ ４
Ａｄｖ ｎｃ ｎｄ Ａｐｐ ｉａ ｉ ｎ ｏ ｈｅＬａ ｃ ｓ ｉｈ Ｙｉｌ ｔａ ｎ ａ ｅａ ｌ ｔｏ ｆｔ ｃ ａ ｅ Ｈ ｇ ｅｄ Ｓ ｒ ｉ ｃ
ＱＮ Ｐ ｎ ．ＷＵＺ ｅ．ｉ ｇ・ Ｉ ｅｇ． ＿ ｈｎｑａ ’ ｎ
（ ． ｏｌｇ ｆ ｉｓｉｎ ｅａ ｄＥ ｇｎ ｅｉｇ ｏ ｔ ｈｎ ｎｖｒｉ ｆ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｕ ｎ ｚｏ ５ ０ ４ １ Ｃ ｌ ｅｏ ｏｃｅ ｃ ｎ ｎ ｉｅｒ ，Ｓ ｕｈＣ ｉａＵ ｉｅｓｔ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ，Ｇ ａ ｇｈ ｕ ６ ０，Ｃ ｉａ ． ｔｔ ｅ ｅ Ｂ ｎ ｙ Ｔ １ ｈｎ ；２ ＳａｅＫ ｙ
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河北农业科学 ，２０ ，１ （Ｏ ０ ８ ２ ｔ ）：１８—１ １ ５ ６ Ｊｕｎｌ ｆＨ ｂｉ ｒ ｕｔｒ ｃｅｃｓ ｏ ｒａ ｏ ｅｅ Ａｓｃｌ ａ Ｓ ｉ ｅ ｉ ｕｌ ｎ
责 任编 辑
李 占东
漆酶 高产 菌研 究 进展 及 应 用
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、绪论漆酶是一种广泛存在于自然界中的酶，具有重要的工业应用价值。
在油漆等化工行业中，漆酶可以加速有机溶剂和有机物的降解，具有分解污染物、提高涂料质量等重要作用。
对于产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的意义。
二、产漆酶菌株的筛选为了筛选出产漆酶的菌株，我们采用了固体培养的方法。
从土壤、水体等环境样品中采集菌株，然后将其进行分离纯化。
在培养基中，我们添加了有机溶剂作为唤醒剂，以刺激菌株产生漆酶。
接着，通过平板筛选法，筛选出产漆酶活性高的菌株。
用甲基橙为指示剂进行酶活性测试，并通过测定橙色环的直径来评价菌株的漆酶活性。
三、产漆酶菌株的鉴定对于筛选出的产漆酶菌株，我们进行了鉴定工作。
采用形态学观察的方法，观察菌株的形态特征，如菌落形状、色泽、边缘和胞外酶的生成情况等。
接着，通过生理生化试验，检测菌株对不同营养物质的利用情况，并对其产生的酶活性进行测定。
通过16S rRNA基因序列分析，确定菌株的种属。
四、产漆酶细菌的固体发酵条件研究为了提高漆酶的产量，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们优化了基础培养基的配方，确定了最适合菌株生长的基础培养基组成。
接着，通过单因素实验和正交实验，优化了培养条件，包括发酵温度、pH值、初始菌量、发酵时间等。
通过对发酵产物的酶活性进行测定，确定了最佳的固体发酵条件。
五、结论通过筛选鉴定和固体发酵条件的研究，我们成功地获得了一株高产漆酶的细菌菌株，并确定了最佳的固体发酵条件。
这为产漆酶的工业化生产提供了重要的理论基础和技术支持，具有重要的应用价值。
我们的研究结果对于深入了解漆酶的产生机制、酶的结构和功能，以及漆酶的应用研究也具有重要的参考意义。
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。
为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。
首先，准备木材素作为酶的底物。
木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。
接下来，采集不同环境中的泥土样品。
漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。
然后，制备泥土微生物的培养基。
泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。
随后，进行菌株的分离与纯化。
将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。
通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。
然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。
接着，筛选高产漆酶的菌株。
采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。
根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。
然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。
将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。
培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。
最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。
通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。
同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。
以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。
通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。
染料脱色菌的筛选及脱色特性研究
染料脱色菌的筛选及脱色特性研究1 前言水是人类生存之源，发展之本，是环境构成中最活跃的因素。
我国常年水资源总储量为2.81万亿m3，居世界第6位，而年总用水量为5 500亿～5 600亿m3，整体上能够满足需求。
但由于我国人口众多，人均水资源占有量不足2 150 m3，为世界人均水资源占有量的1/4，位列世界110位，是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一。
而且，随着人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，加之水资源时空分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。
据美国对外关系委员会亚洲研究中心的报告，中国668个城市中440个已出现长期缺水问题。
20世纪90年代以来，国家累计投入600亿元治理江河污染，相关部门也大力采取防污治污的措施，使得河流、湖泊、水库的水质基本保持稳定，局部有所改善。
但据《中国环境状况公报》显示，2007年我国水污染形势依然严峻，监测的197条河流的407个断面中，Ⅰ～Ⅲ类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为49.9 %、26.5 %和23.6 %。
因此，防治水资源污染，提高水环境质量，已成为当务之急。
印染产生的废水主要特点有：①水量大；②浓度高，大部分废水呈碱性,COD 值较高，色泽深；③水质波动大，印染厂的生产工艺和所用染化料，随纺织品种类和管理水平的不同而异，而对于每个工厂，其产品都在不断变化，因此，废水的污染物成分浓度的变化与波动十分频繁；④以有机物污染为主，除酸、碱外,废水中的大部分污染物是天然或合成有机物；⑤处理难度较大，染料品种的变化以及化学浆料的大量使用，使印染废水含难生物降解的有机物，可生化性差。
⑤印染废水的色泽深，严重影响着水体外观。
造成水体有色的主要因素是染料。
可见印染废水是较难处理的工业废水之一。
目前全世界染料年总生产量在60 万t 以上，其中50 %以上用于纺织品染色；而在纺织品印染加工中，有10 %～20 %的染料作为废物排出。
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高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【摘要】[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株.[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果.[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb.菌株CLb最适生长温度为37 ℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性.以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重.菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0.在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4h内对活性黑以及在2h内对靛红的脱色率均达到93.0％,在6h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0％和92.5％.[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P1614-1616,1654)【关键词】细菌漆酶;芽孢杆菌属;染料脱色【作者】李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【作者单位】东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江省实验中学,黑龙江哈尔滨150001;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(EC 1.10.3.2，p-diphenol:dioxygen oxidoreductases)是一种含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水［1］。
漆酶参与生物合成和木质素降解。
白腐菌漆酶对木质素的降解效果较好［2］。
因此，真菌漆酶应用于木质素和纤维材料的修饰及去木质素方面有较好的前景。
漆酶作用的底物范围很广，可应用于工业废水脱毒、纸浆造纸、纺织业和石化工业以及作为生物修复剂清理除草剂和杀虫剂［3］。
20世纪以前，对漆酶的研究主要集中在真菌漆酶［2］，对原核生物中漆酶的研究少有报道。
Alexandre等［4］根据分子数据分析，提出漆酶基因可能广泛存在于细菌中。
自1983年首次发现原核生物生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)具有漆酶活性［5］，随后陆续有报道证实海单胞菌(Marinomonas mediterranea)［6］、大肠杆菌(Escherichia coli)［7］、黄色链霉菌(Streptomyces galbus)［8］以及天蓝色链霉菌(S.coelicolor)［9］等菌株具有漆酶活性。
虽然大多数细菌漆酶与真菌漆酶相比产量少且氧化还原电位较低，但是细菌漆酶具有不需糖基化，具有较好的热稳定性和pH范围广泛等优点［10］，使得细菌漆酶比真菌漆酶更适合基因操作和构建重组酶［11］。
细菌生长繁殖速度较快，研究周期较短，使得高产漆酶菌株的筛选以及分离鉴定具有高效性。
笔者从东北林业大学实验林场樟子松林的土壤中采集样品，利用含铜的富集培养基筛选出一株高产漆酶的细菌菌株CLb，通过形态学、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，将菌株CLb初步鉴定为芽孢杆菌属，并对菌株的生物学特性及其对染料的脱色效果进行研究，为细菌漆酶应用于染料脱色提供理论基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤样品。
取自东北林业大学实验林场樟子松林下土壤。
1.1.2 培养基。
5×M9盐溶液:Na2HPO7·H2O 64 g/L，KH2PO415 g/L，NaCl2.5 g/L，NH4Cl 5 g/L;M9 培养基:20%葡萄糖20 ml/L，5×M9盐溶液200ml/L;富集培养基:CuSO4·5H2O 0.05 g，M9培养基1 000 ml;LB培养基:胰蛋白胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 17 g/L，pH 7.0。
1.2 方法1.2.1 高产漆酶菌株的筛选及分离纯化。
称量采自东北林业大学实验林场樟子松林的土壤样品10 g，将土样加入于120 ml M9培养基，振荡混匀，150 r/min，37℃培养2 d，继代培养2次，将培养液适当稀释后涂布于含0.2 mmol/L Cu2+的LB 平板上，37℃培养3 d。
用浓度0.1%丁香醛连氮(无水乙醇溶解)溶液对上述平板菌落进行鉴定。
挑取对丁香醛连氮显现粉红色的单菌落划线于含0.4 mmol/LCu2+的LB培养基上，重复操作3次，得到产漆酶细菌的单克隆，选取显色最深的菌株进行研究。
1.2.2 菌株CLb的形态学及生理生化特性测定。
对菌株CLb进行革兰氏染色，测定糖类发酵、淀粉分解等生理生化特性［12］。
1.2.3 菌株CLb的16S rDNA序列分析。
以CTAB法提取的菌株CLb的总DNA为模板，以16S rDNA通用引物27F:5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇和 1492R:5＇-ggttaccttgttacgactt-3＇扩增菌株CLb的16S rDNA。
反应体系为:ddH2O 22μl，10 × Ex buf fer缓冲液3 μl，dNTP 2 μl，引物 27F 和 1492R 各1 μl，模板DNA1 μl，Taq 聚合酶0.2 μl。
反应条件为:94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃变性18 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸78 s，循环30次，72℃终延伸7 min，4℃保存。
以小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将胶回收产物与pMD18-T连接，将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，37℃培养过夜。
将用菌落PCR鉴定为阳性的转化子，送北京英骏生物工程有限公司测序。
1.2.4 构建菌株CLb的系统发育树。
将测定的结果在NCBI的BLAST上搜索比对，利用Clustal软件进行多序列比对，用Phylip-3.69软件中的最大简约法构建该菌株的系统发育树。
1.2.5 菌株CLb的生物学特性研究。
对菌株CLb的生长曲线、最适生长温度、最适生长pH、耐盐性以及Cu2+抗性等5个方面进行研究。
1.2.6 芽孢漆酶液的制备。
将菌株 CLb接种于含0.2 mmol/L Cu2+的LB固体培养基中，37℃倒置培养5 d。
粗酶液的制备方法参照文献［13］。
1.2.7 芽孢漆酶活性的测定。
0.2 mol/L磷酸氢二钠－0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 7.0)、0.5 mol/L丁香醛连氮及一定量的芽孢粗酶液在37℃反应3 min，用分光光度计测定525 nm处的吸光值，重复3次，取平均值。
一个酶活单位定义为1min内氧化1 μmol底物所需的酶量。
1.2.8 菌株CLb芽孢漆酶对染料脱色的研究。
取一定体积的粗酶液于80℃烘箱中烘至恒重，计算粗酶液中芽孢的浓度(mg/ml)。
染料脱色体系包括染料、芽孢漆酶液(终浓度为1 mg/ml)以及0.2 mol/L磷酸氢二钠－0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 7.0)，其中活性亮蓝RBBR、活性黑、靛红以及结晶紫的终浓度分别为100、40、25、5 mg/L，最大吸收波长分别为591、597、610以及583 nm。
40 ℃，160 r/min脱色，定时取样，14 000 r/min离心1 min后用分光度计测定各种染料在最大吸收波长处的吸光值。
每种染料体系重复3次，取平均值。
同时，设不加粗酶液的空白对照体系。
式中，A0为初始染料吸光值;A为定期取样测的吸光值。
2 结果与分析2.1 菌株CLb筛选及其生理生化特性从筛选的菌株中选取对丁香醛连氮显红色最深的一株细菌CLb进行研究。
菌株CLb的革兰氏染色结果为蓝紫色，是革兰氏阳性细菌，细胞大小为(1 μm ～2 μm)× (5 μm ～7 μm)，短杆状，有芽孢，具有侧鞭毛和荚膜;在LB固体培养基上，37℃培养24 h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。
菌株CLb V-P试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，丙二酸盐试验呈阳性。
芽孢杆菌CLb可利用麦芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖和乳糖。
芽孢杆菌CLb含明胶液化酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和尿素酶。
2.2 菌株CLb的16S rDNA序列分析菌株CLb的16S rDNA经测序为1 514 bp。
利用Clustal软件多序列比对，用Phyilp构建系统发育树(图1)。
在NCBI上用BLAST软件比对，它与韦氏芽孢杆菌的相似度为94%。
结合形态学观察、生理生化特性以及16S rDNA同源性分析比对，确定该菌株属于芽孢杆菌属，定名为Bacillus sp.CLb。
图1 根据16S rDNA序列分析和最大简约法构建的系统发育树2.3 菌株CLb的生长特性根据所测OD600数值，显示出菌株CLb在1～3 h之间生长缓慢;5～15 h进入对数生长期;25 h后进入稳定期。
由图2可知，菌株CLb 的最适生长温度为37℃，25～42℃时该菌株均能生长，但50℃下菌株几乎不能生长。
由图3可知，菌株CLb的最适生长pH为7，pH 5～9菌株CLb生长良好，但是pH为4和11时菌株几乎不能存活。
由图4可知，菌株CLb的耐盐性良好，菌株CLb能在NaCl浓度为1% ～5%的范围内生长良好，NaCl浓度高于7%时菌株CLb生长缓慢。
由图5可知，菌株CLb对Cu2+的抗性比较强。
当培养基中Cu2+浓度为0～0.6 mmol/L时，对菌株CLb生长基本无影响，当Cu2+浓度为0.8～1.5 mmol/L时，其生长速度逐渐减慢。
该菌株为耐铜离子的细菌。
利用这一特性，可以提高对其富集和筛选的效率。
2.4 菌株CLb芽孢漆酶对染料脱色的结果由图6可知，在不含介体的脱色体系中，菌株CLb的芽孢粗酶液只能对结晶紫进行脱色，6 h内脱色率为90%，对其他3种染料均不脱色。
在脱色体系中加入介体乙酰丁香酮(Ace)后，缓冲液pH为7的条件下，菌株CLb芽孢漆酶在4 h内对活性黑以及在2 h内对靛红的脱色率均达到93%，在6 h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79%和92.5%。
当缓冲液pH为9时，菌株CLb芽孢漆酶同样能降解活性黑、靛红和结晶紫，其芽孢漆酶在4 h之内能完成脱色，脱色率分别为81.0%、85.3%和 93.5%。