染料脱色菌的筛选及脱色特性研究

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红平菇HP1锰过氧化物酶基因克隆及染料脱色的研究

红平菇HP1锰过氧化物酶基因克隆及染料脱色的研究郑苗苗;张令昂;焦战战;邵淑丽【摘要】采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基添加方式,对红平菇HP1(Pleurotus djamor)进行培养,检测不同时间培养液对不同底物的氧化作用,作为锰过氧化物酶的产生及活性测定的主要依据.在含Mn2+的培养液添加底物木屑后锰过氯化物酶最大酶活为358.7 U·L-1,提取经优化筛选后的锰过氧化物酶粗酶液,对4种具有不同化学结构的染料进行了脱色试验.结果表明,对异戊二烯类番红在6h时脱色宰为82.6％.因此,显示出红平菇HP1锰过氧化物酶对番红染料脱色具有较大的应用潜力,进而对废水处理具有更好的应用前景.采用RT-PCR和RACE技术,从红平菇HP1菌株中获得编码锰过氧化物酶基因的cDNA及DNA基因的全长序列,基因组大小为1404 bp.比较该锰过氯化物酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含5个外显子和4个内含子.cDNA序列的全长为1199 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1095 bp,编码365个氨基酸.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2015(028)004【总页数】7页(P1757-1763)【关键词】红平菇HP1;锰过氧化物酶;产酶条件;染料脱色【作者】郑苗苗;张令昂;焦战战;邵淑丽【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】S646.14锰过氧化物酶(Manganese peroxidase)是一种依赖H2O2的亚铁血红素糖基化胞外过氧化物酶，广泛分布于白腐菌中[1～3]。

由于对木质素中酚类和非酚类结构单元及多环芳烃具有较强的降解能力，能够有效降解土壤和废水中极难降解的各种异生芳香化合物及复杂的木质素聚合物，由此锰过氧化物酶生物催化作用在环保行业具有潜在的应用价值[4]。

印染废水脱色菌的选育及研究

维普资讯
第２５卷第１期报（然科学版）自
Ｊｕａｏｎｖｒｉｆｃｅｃｎｅｈｏｇｆｕｈｕ（ａｕａｃｅｃ）ｏｒｌｆＵｉｓｙｏｉｎｅａｄＴｃｎｌｙｏｚｏＮｔｒｌｉｎｅｎｅｔＳｏＳＳ
Ｖｏ．５Ｎｏ１１２．
Ｍａ．２０ｒ０８
印染废水脱色菌的选育及研究
陈熙，谢经良，姚明修
（岛理工大学环境与市政工程学院，东青岛２６３）青山６０３摘要：印染厂污水处理站的活性污泥中分离出五株有脱色能力的菌株（１、３、４Ｔ）其中Ｔ从Ｔ、１Ｔ、５，４菌株降解能
中图分类号：７１Ｘ９文献标识码：Ａ文章编号：１７－６７２０）１０３－４６２０８（０８０－０５０
印染废水是目前主要的水体污染源之一。它含大量的有机污染物，排入水体将消耗溶解氧，坏水生态破平衡，危及鱼类和其它水生生物的生存。沉于水底的有机物，因厌氧分解而产生硫化氢等有害气体，会恶化环境。料废水的高色度会影响水体中动植物的生长繁殖，染妨碍水体的自然净化，坏水体的生态系统。破由此
力最强。实验表明，当培养温度为３，Ｈ值为７０投菌量１％时，４℃ ｐ．，０脱色效果最好，色率可达８．％。另外，脱４５混合
菌的脱色效果要优于Ｔ４单菌株，色率可提高至８．。脱７６％关键词：性蓝Ｋ印染废水；色；物降解活Ｒ；脱生

一种筛选染料脱色真菌的新方法——脱色圈法

ＡｗｅｈｄｔｌｃｉｅＮｅＭｔｏｏＳｅｅｔｎｇＤｙ－ｄｅｏｏｉｉｇＢａｔｒａ－ｃｌｒｚｎｃｅｉ－ＤｅｏｏｉｉｒｌｃｌｒｚｎｇＣｉｃｅ
ＷＥＩｏｙｎ ’ Ｂａ－ａｇ，ＨＥＬｎ — ｅ，ｏｇｚＧＯＮＧ — ｉＬｉ－ｌｎ。Ｓｉｑ。Ｉｎｏｇ，Ｊ
ｇｒ）蛋白核小球藻（ｈｏｅｌｙｅｏｄｓ）真菌ａｉ、ｓＣｌｌｐｒｎｉｏａ，ｒａ中的黄孢原毛平革菌（Ｐａｅｏｈｅｅｃｒｓｓｏｉｈｎｒｃａｔｈｙｏｐｒ — ｕ）５ｎｒ等［１。为此，者设计了一种从土壤中分离筛选笔印染废水处理用微生物的新方法— — 脱色圈法，旨在筛选对染料有明显脱色能力的真菌，为处理印染
废水提供参考。
到不同程度的污染，造成污染加重的主要因素是工
业废水和生活污水的排放，污染已经成为严重的水社会问题ｆｌ＿织印染工业是现代工业中对环境造。纺成严重污染的产业之一据不完全统计，织印染。纺业废水排放量居全国工业行业第５位，废水排放其
ＫｅｒｓＡｓｅｇｌｓｎｇｒｓｒｉ；ｏｅＢｎａ；ｅｏｏａｉｎｙｗｏｄ：ｒｉｕｉｅ；ｔｎｒｓｅｇｌｄｃｌｒｔｐｌａｏ
据国家环保总局对我国水环境污染现状的统计与调查，国的江河、泊及近海流域已普遍受我湖
为指示染料的脱色透明圈法分离染料脱色菌的效果好，是一种简单、方便有效的方法。

活性深蓝H14B印染废水脱色菌的筛选及脱色条件研究

下层为染料固０１；Ｓ４・Ｈ２００ｇ蛋白胨０５；．ｇＭｇＯ７Ｏ，．５；．ｇ葡萄糖ｌ；养基制备的平板浓度梯度进行筛选，ｇ体培养基，层为固体培养基。尽可能挑选染料高上
１２试验仪器．
２３Ｃ．ＯＤｃ、ＯＤ的测定方法ｒＢｓ
ＣＤＯ采用重铬酸钾法；Ｏ用稀释培养法。ＢＤ采
Ｓ２２ＵＰ一１０Ｖ型紫外可见光分光光度计、Ｉ一２２４脱色菌的筛选ＬＭ．低速型离心机、ＤＬ６Ｈ计、Ｐ２０恒温培２４１脱色菌的筛选流程ＭＯＥ８８ｐＳＸ一５．．养箱、ＹＨＧ—Ｉａ恒温摇床。Ｉ型样品及其预处理一驯化培养一染料梯度平板筛
染色、印花废水与其他工序产生的废水混合稀释，以ＮＨＰ４・ＨＯ，．ｇＭｇＯ７Ｏ，．５；白胨ａ２Ｏ２２０１；Ｓ４・Ｈ２００ｇ蛋降低废水的色度，少对生物处理池中微生物的毒０５；萄糖ｌ；Ｈ自然。减．ｇ葡ｇｐ
关键词：废水；脱色茵；生物降解中图分类号：Ｓ９Ｔ１９文献标识码：Ａ文章编号：６２—１７（０８０００— ４１７１９２０）３— ５０
纺织印染企业产生的废水的常规处理方法是将
（）５染料液体培养基的组成（：％）染料０００；．０５
赵颖赵军杨玉杰
（华侨大学环境保护设计研究所，州泉

孔雀石绿脱色研究

孔雀石绿脱色研究1 引言合成染料广泛应用于印染、制皮、化妆品、印刷、医药和食品加工等行业，然而，这些染料大多数都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然环境中极难生物降解，对光、生物酶和其他环境条件的抵抗力极强.孔雀石绿作为一种三苯甲烷类染料，广泛应用于水产养殖业、食品加工业、医药行业等各个领域中.随其广泛使用，该染料对哺乳动物细胞、水生生物和其他有机生命体的致癌致畸效应也凸现出来，引起了科学界的广泛关注.因此，在许多国家和地区，该染料已被立法严禁使用，且被美国食品和药物管理局列为致癌性测试的优先化学物质之一.然而，由于孔雀石绿的生产成本较低、稳定性强且使用效果较好，难以找到合适的替代物，导致很多地区仍在广泛使用该染料，严重破坏了使用地区的生态平衡尽管许多科学工作者已致力于解决由孔雀石绿造成的环境污染问题，例如应用吸附、化学沉淀、光降解、渗透和膜过滤等理化处理技术处理污染水源;然而，由于这些处理方法不仅处理费用高、效率不高，而且在治污的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用.生物处理技术作为一种环境友好型且高效低耗的处理手段受到越来越广泛的关注.其中，细菌由于生长速度快，容易获得大量生物量，且易产生大量降解相关酶，对染料的降解效率也较高等优势而受到环境工作者的青睐.本研究的目的在于：①广泛筛选浙南地区的MG高效脱色菌株;②初步鉴定MG高效脱色菌株为DH-9;③采用单因素实验研究菌株DH-9对MG的脱色特性，并采用响应面设计优化脱色条件.2 材料与方法2.1 实验材料 2.1.1 菌种来源供试土样取自浙江温州双屿皮革城和温州大罗山果园，菌株DH-9来源于常年被皮革废水污染的污泥中.2.1.2 试剂孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，购自国药集团化学试剂有限公司;革兰氏染色液;TE缓冲液;Tris饱和酚(pH 8.0);氯仿;10×PCR缓冲液、DNA 连接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化试剂均为国产分析纯.2.1.3 培养基无机盐培养基(MSM)组成(g · L-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 · 7H2O，0.491;CaCl2 · 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培养基组成(g · L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.0~7.2.纯化培养基组成(g · L-1)：在MSM培养基中添加终浓度为200 mg · L-1的MG染料.2.2 实验仪器超净工作台;电热恒温鼓风干燥箱;高压蒸汽灭菌锅;全温恒温摇床;电子天平;pH计;高速冷冻离心机;Evolution 260紫外可见光分光光度计;Bio-rad PCR仪、自动凝胶图像分析仪及水平电泳仪等.2.3 实验方法 2.3.1 MG高效脱色菌株的富集、分离和纯化方法将1.0 g土样接入已灭菌的含100 mL MSM培养基的三角瓶中，同时在MSM培养基中添加已过滤除菌的MG母液作为唯一碳源，使其终浓度为20 mg · L-1.将三角瓶置于30 ℃、180r · min-1摇床中振荡培养1周后，吸取1 mL培养液转接至新鲜培养基(含40 mg · L-1的染料)中，连续驯化、富集.转接多次后，培养物可耐受的染料终浓度为200 mg · L-1.用接种环蘸取少许富集培养液，在纯化培养基平板上直接划线分离.在平板上选择不同形态特征的单菌落，重新转接至含200 mg · L-1 MG的纯化培养基平板上，转接多次直至获得单一形态的MG脱色菌纯培养物.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增与序列分析(1)提取基因组DNA：采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤参考《分子克隆实验指南》.(2)16S rRNA基因PCR反应：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反应的引物为一对通用引物，正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′;反向引物BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程有限责任公司完成.所得序列用BLAST 程序与GenBank数据库(/blast)中的菌株进行比对，选取一些具有代表性的菌株用于系统发生树的构建.采用软件CLUSTAL X 1.8.3进行DNA序列同源性比较.比对结果用MEGA 4.1软件中的Neighbor-Joining的距离模进行UPGA分析后生成系统发育树.2.3.3 菌株DH-9对MG的脱色特性研究(1)培养基起始pH值对MG脱色的影响：用1.0 mol · L-1的HCl或NaOH将2.0 g · L-1酵母粉溶液的初始pH值分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.灭菌后添加过滤除菌的MG，使MG终浓度为100 mg · L-1，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(2)培养温度对MG脱色的影响：分别设定培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃.在2.0g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于180 r · min-1条件下振荡培养.(3)接种量对MG脱色的影响：在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，分别接种1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9过夜培养物，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(4)碳氮源对染料脱色的影响实验：将所选碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分别添加至MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.将所选氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分别添加至无NH4Cl的MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).(5)金属离子对MG脱色的影响：分别向2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加终浓度为1.0和2.0 mmol · L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).所有实验均重复3次以上，并同时设置对照实验.2.3.4 响应面设计优化菌株DH-9对MG的脱色条件在单因素实验的基础上，采用中心组合试验设计(Central Composite Design，CCD)对MG脱色条件进行优化，培养8 h后测定其脱色率.用标准多项式回归方法，对CCD设计实验数据进行拟合，得到一个二次多项式：式(1)中，Y为预测目标函数;β0为常数;βi为线性系数;βii为平方系数;βij为交互作用系数.本实验采用五因素三水平CCD设计来研究操作参数对MG脱色的影响，具体设计如表 1所示.2.4 数据统计分析CCD实验设计数据采用Minitab 14.0软件进行统计分析.3 结果与分析 3.1 MG高效脱色菌株的筛选与鉴定经多次富集、纯化培养后，获得了多株对MG有一定脱色能力的菌株，其中菌株DH-9对MG 的脱色效果最好，同时，全波长扫描结果显示脱色后有新的吸收峰产生(数据未给出)，加之脱色后菌体沉淀呈现无色，推测该菌株对MG的脱色可能是由生物降解引起的.因此，随后着重对菌株DH-9进行了鉴定.革兰氏染色结果显示菌株DH-9是革兰氏阴性菌，短杆状.菌落呈现圆形，乳白色，半透明，表面光滑湿润.以菌株DH-9基因组为模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，检测PCR产物、回收、纯化后测序，获得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登录序号为KC736654.该序列经与GenBank中的数据比对后发现，其相似度与Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度达到98%以上，并且在系统进化树中也与该菌株聚类在一起(图未给出)，表明菌株DH-9属于肠杆菌属.3.2 菌株DH-9对MG的脱色特性 3.2.1 pH值和温度对MG脱色的影响培养基初始pH值对MG脱色影响的结果如图 1a所示.培养12 h时，pH值在4.0~9.0之间的MG培养基脱色率在90%以上.培养24 h以后，pH值在3.0~9.0之间的MG培养基脱色率均在90%以上，说明该菌株对MG脱色的pH适应性较强，实际应用潜力较大.图 1图 1 pH(a)和温度(b)对MG脱色的影响温度对MG脱色的影响结果如图 1b所示.由图可知，培养12 h时，温度为30~40 ℃间的MG 脱色率在90%以上.随着脱色时间的延长，当培养时间超过24 h后，所测温度范围内(15~40 ℃)的MG脱色率均超过90%，表明该菌株对MG脱色的最适温度范围为30~40 ℃，温度适应性较好.碳氮源对MG脱色的影响如图 2a、图 2b所示.实验结果表明，培养48 h以内时，多数所测试碳源对MG脱色有抑制效应或无显著影响;而当培养时间超过72 h后，多数所测试碳源对MG脱色有促进作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促进效果最为显著，总体而言，所测试碳源中以半乳糖对MG脱色的促进效果最好.与碳源相比，多数所测试氮源对MG脱色的促进效果优于碳源，实验中所测试的氮源均能显著促进MG脱色.有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比无机氮源(NH4Cl和NaNO3)的促进效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促进效果最好.图 2图 2 碳(a)、氮(b)源和金属离子(c)对MG脱色的影响 (1.1.0 mmol · L-1氯化铜; 2.2.0 mmol · L-1氯化铜; 3.1.0 mmol · L-1氯化铁; 4.2.0 mmo · L-1氯化铁; 5.1.0 mmol · L-1氯化钙; 6.2.0 mmol · L-1氯化钙; 7.1.0 mmol · L-1氯化锌; 8.2.0 mmol · L-1氯化锌;9.1.0 mmol · L-1氯化镁; 10.2.0 mmol · L-1氯化镁; 11.1.0 mmol · L-1氯化锰; 12.1.0 mmol · L-1氯化锰) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol · L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol · L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol · L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol · L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol · L-1 CaCl2; 6.2.0 mmol · L-1 CaCl2; 7.1.0 mmol · L-1 ZnCl2; 8.2.0 mmol · L-1 ZnCl2; 9.1.0 mmol · L-1 MgCl2; 10.2.0 mmol · L-1 MgCl2; 11.1.0 mmol · L-1 MnCl2; 12.1.0 mmol · L-1MnCl2) 金属离子对MG脱色的影响如图 2c所示.由图可知，大多数所测试金属离子对MG脱色没有显著效应，仅Cu2+和Fe3+对MG脱色有显著抑制效应，钙离子对脱色有微弱促进效应.3.2.3 接种量对MG脱色的影响接种量对MG脱色的影响结果如图 3所示.当接种量从1%上升至3%时，MG脱色率上升趋势显著;而当接种量继续增大时，MG脱色率变化趋势则趋于平稳，均维持在90%以上.图 3图 3 接种量对MG脱色的影响3.3 菌株DH-9对MG的最优脱色条件 3.3.1 回归方程和预测模型的构建采用CCD设计优化MG的脱色条件和研究主效应因子间的交互作用，实验结果和模型预测结果如表 1所示.实验所得培养8 h后的孔雀石绿的脱色率分布在78.0%~99.2%之间，说明主效应因子对MG脱色影响显著.MG脱色率的实验值和预测值基本保持一致，说明所获得模型精确性较高.所获得模型的回归系数和统计学分析(ANOVA)结果如表 2和表 3所示.结果显示，模型的决定系数R2和校正决定系数(adjusted R2)分别为99.7%和99.2%，这就说明该模型精确性较高，可以用于MG脱色率的预测.因此，适于预测MG脱色率的二次模型公式可表示如下：式(2)中，DP是MG的脱色率，A到D是CCD设计的5个自变量，分别为pH、温度、半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度.回归分析的F值和p值分别为201.26和<0.001，这说明该模型的显著性较高.线性和交互作用选项的p值也<0.001，这说明线性选项和交互作用选项AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE对MG脱色的影响显著.此外，“lack of Fit”选项的F值和p值分别为4.57和0.058，说明相对于纯误差“lack of Fit”不显著，进而说明该模型与响应值(MG的脱色率)的拟合效果较好.3.3.2 主效应因子间的相互作用用Minitab 14.0软件分析获得的因素间交互作用的2D图如图 4～6所示.图 4显示了pH 和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明pH和这3种因素之间的交互作用显著.如图所示，随着pH值逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先升高再降低的趋势.图 4图 4 pH和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 5显示了温度和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明温度和这3种因素之间的交互作用显著.由图可知，随着温度逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先降低再升高的趋势.图 5图 5 温度和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 6显示了半乳糖浓度和酵母粉、氯化钙浓度之间以及酵母粉浓度和氯化钙浓度之间的显著的交互作用及其对脱色的联合影响.图 6a和6b表明随着半乳糖浓度的逐渐升高，脱色率随酵母粉和氯化钙浓度的升高而呈现降低趋势.由图 6c可知，随着酵母粉浓度的逐渐升高，脱色率随氯化钙浓度的升高也呈现降低趋势.图 6图 6 半乳糖和酵母粉(a)、氯化钙(b)及酵母粉和氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响3.3.3 预测模型的验证为了确定CCD实验所获得二次模型的精确性，我们进行了验证实验.由软件分析获得的最优操作参数如下：pH值为6.0，半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度分别为1.0 g · L-1、1.0 g · L-1和3.0 mmol · L-1，培养温度为34.5 ℃.在此条件下进行的验证实验结果表明孔雀石绿的最高脱色率为99.4%，在置信范围(100%±1%)区间内，因此，该模型对响应值的拟合效应较好.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。

红平菇漆酶基因异源表达及对染料脱色的研究

红平菇漆酶基因异源表达及对染料脱色的研究郑苗苗;邵淑丽;张东向;张令昂;焦战战【摘要】以白腐菌红平菇Pleurotus djamor RNA为模板,通过RT-PCR(反转录)得到红平菇漆酶Pd-lac1基因的完整CDS序列.构建毕赤酵母表达载体pPICZB-Pd-Lac1(重组表达载体),并通过电转化法导人毕赤酵母Pichia pastoris中,通过PCR结果证明,Pd-lac1的CDS序列部分阳性转化子已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上.经液体摇瓶培养后筛选出蛋白表达较高的酵母工程菌株,漆酶活力达54 U/L.进而研究了重组漆酶对染料脱色的影响.结果表明:重组漆酶对蒽醌类SN4R脱色可达52.8％;杂环类中性红、偶氮类甲基橙和三苯基甲烷类孔雀绿的脱色率低于SN4R,脱色率分别为14.8％、14.5％、0.24％,显示出重组漆酶对SN4R脱色效率具有较大的应用潜力,从而对含蒽醌类染料的废水处理具有更广的应用前景.【期刊名称】《纺织学报》【年(卷),期】2014(035)012【总页数】7页(P84-90)【关键词】红平菇;漆酶基因;毕赤酵母;异源表达;染料脱色【作者】郑苗苗;邵淑丽;张东向;张令昂;焦战战【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006【正文语种】中文【中图分类】TS199;Q75漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族[1]。

漆酶通过催化O2 将4个电子还原生成水，底物作用范围广泛，在很多方面有较大的应用价值[2-3]。

最早由日本吉田在漆树的分泌物中发现漆酶，随后又在一些真菌中发现漆酶。

生物菌对活性染料的脱色研究

生物菌对活性染料的脱色研究
吴赞敏，吕彤，亮，翁戴晓红
（天津工业大学材料与化工学院，天津摘要３０６）０１０
从印染污水处理厂的活性污泥中分离、筛选得到一株能使活性染料兰纳素蓝３Ｂ脱色的优良菌株ｗ。研
究了在不同条件下如温度、时间、Ｈ值和接种量等，ｐ该菌对毛用活性染料兰纳素蓝３Ｂ脱色性能的影响。通过实验优化了Ｗ２菌及其对活性染料兰纳素蓝３Ｂ染色废水脱色的最佳条件。
（ｃｏｌｆＭｔｉｌｉｃｎｈｍｃｌｎｉｅｉＳｈｏｏａｒｅｅａｄＣｅｉｇｎｒｇ，ＴｎｎＰｌｅｎｎｅｉ。ｉｊ３０６Ｃｉ）ｅａＳｎｃａＥｅｎｉｊｏｔｈｉＵｉｒｔＴｎｎ０１０。ｈａａｉｙｃｃｖｓｙａｉｎ
物形成一个复杂的食物链。本文对印染厂污水积聚的活性污泥进行处理和微生物的培养、分离及纯化，以得到对染料脱色效果好的微生物菌株。
ｓｒｉｎｔｉｃｌｒｔｎｏａｎｏｕｔｄｆｅｅｔｔｍｐｒｔｒ，ｄｒｔｎｏｒａｍｅｔＨａｕｔｎＷ２ｏｈｅｄｓｏｏａｉｆ［ａｌＢｌｅ３Ｂａｉｒｎｅｅｕａｏｓａｅｕａｉｆｔｔｎ，ｐｖｅ，ｏｅｌ
关键词微生物；色；性染料；物降解脱活生文献标识码：Ａ
中圈分类号：７１Ｘ９
Ｍｉｒｂａｅｏｏｉａｉｎｏｅｃｉｅｄｅｃｏｉｌｄｃｌｒｚｔｏｆｒａｔｖｙ

溴氨酸脱色菌的筛选及其特性的初步研究

ｌｖｓｉａｉｎ０ｎｔｅｉｏａｉｎａｄｃａａｔｒａｉｎｏｒｍａｎｎｅｔｔｈｓｌｔｎｈｒｃｏｉｔｆｂｏｇｏｏｚｏｍｉｅ
ａｉ－ｅｏｏｚｎｔｉｓｃｄｄｃｌｄｉｇｓｒｎａ
李莹，宝立，蔡庄源益，丁春丽
（南开大学环境科学与Ｓ程学院，－天津３０７）００１
［摘要］从化工厂污泥中分离筛选出ｌ０个对蒽醍染料中问体溴氨酸有显著降解脱色作用的菌株。对脱色效果最好的Ｎ１菌株进行了特性研究。试验结果表明，ｌ菌株能以溴氨酸为唯一碳源生长，溴氨酸为唯一氮源时Ｎ生长及脱色速度大大下降。其脱色效果受温度、Ｈ条件影响较大。最佳生长条件是３ｐ０℃ 、Ｈ７２ｐ［关键词］溴氨酸；生物降解；菌株筛选［中图分类号］Ｘ８［７８文献标识码］Ｂ［文章编号］１００５—８９２ｏ）２— ０２３２Ｘ（ｏ２００２ —０
ｄｅ．ａｅｂｅｓｌｔｄｆｍｌｄｅｏｈｍｉａｏａｔＩｖｓｉａｉｎｏｈｈｒｔｒｔｆｓａｎＮ１ａｅｎｙｈｖｅｎｉａｅｒｏｏｓｕｇｆｃｅｃｌｌｎ．ｎｅｔｔｆｔｅｃａａｅｉｉｏｔｉｈｓｂｅｇｏｃｓｃｒ
维普资讯
２００２年２月
工业水处理
ＩｄｓｒａｅｒａｍｅｔｎｕｔａＷｔｒＴｅｔｎｉｌ
Ｆｂ，０２ｅ２０Ｖｌ２．ｏ－２Ｎｏ２

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染料脱色菌的筛选及脱色特性研究
1 前言
水是人类生存之源，发展之本，是环境构成中最活跃的因素。

我国常年水资源总储量为2.81万亿m3，居世界第6位，而年总用水量为5 500亿～5 600亿m3，整体上能够满足需求。

但由于我国人口众多，人均水资源占有量不足2 150 m3，为世界人均水资源占有量的1/4，位列世界110位，是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一。

而且，随着人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，加之水资源时空分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。

据美国对外关系委员会亚洲研究中心的报告，中国668个城市中440个已出现长期缺水问题。

20世纪90年代以来，国家累计投入600亿元治理江河污染，相关部门也大力采取防污治污的措施，使得河流、湖泊、水库的水质基本保持稳定，局部有所改善。

但据《中国环境状况公报》显示，2007年我国水污染形势依然严峻，监测的197条河流的407个断面中，Ⅰ～Ⅲ类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为49.9 %、26.5 %和23.6 %。

因此，防治水资源污染，提高水环境质量，已成为当务之急。

印染产生的废水主要特点有：①水量大；②浓度高，大部分废水呈碱性,COD 值较高，色泽深；③水质波动大，印染厂的生产工艺和所用染化料，随纺织品种类和管理水平的不同而异，而对于每个工厂，其产品都在不断变化，因此，废水的污染物成分浓度的变化与波动十分频繁；④以有机物污染为主，除酸、碱外,废水中的大部分污染物是天然或合成有机物；⑤处理难度较大，染料品种的变化以及化学浆料的大量使用，使印染废水含难生物降解的有机物，可生化性差。

⑤印染废水的色泽深，严重影响着水体外观。

造成水体有色的主要因素是染料。

可见印染废水是较难处理的工业废水之一。

目前全世界染料年总生产量在60 万t 以上，其中50 %以上用于纺织品染色；而在纺织品印染加工中，有10 %～20 %的染料作为废物排出。

印染废水的色度严重，用一般的生化法难以去除。

染料废水的污染，势必影响到人畜饮水安全、水体养殖生产、农业种植等各方面，应采取得力措施进行防控和处理染料污水。

根据环境污染治理专家研究发现，治理染
料污水最有有效的方法是生物法，生物法除了效果明显，也是对环境危害最小，是一种环境友好的除污方法。

本实验即是从生物防治染料污水的角度出发，从污水中提取脱色细菌，并对其进行一系列实验，包括①染料脱色菌的富集、分离②染料脱色菌的驯化培养③染料脱色菌脱色能力的测定④染料脱色菌生长曲线的测定。

2 实验器材
2.1 材料
2.1 菌种来源：各组自选污水
2.2 染料
孔雀石绿，最大吸收波长为617nm
2.3 培养基
富集培养基：KH
2PO
4
1g， (NH
4
)
2
SO
4
1g，MgSO
4
·7H
2
O 0.5g，NaCl 0.5g，
牛肉膏1g，水1000ml，pH值为7.0，121℃下灭菌20min。

基础培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g, NaCl 5g, 水1000ml，pH值为7.0, 121℃下灭菌20min。

脱色培养基：孔雀石绿的质量浓度为100mg/L。

2.4 主要仪器
电热恒温培养箱、光照培养箱、台式高速离心机、752型紫外可见分光光度计、台式压力蒸气灭菌锅、冰箱、电子天平、恒温振荡器、培养皿、试管、玻璃棒、烧杯、电炉、250ml锥形瓶、接种环、酒精灯、移液管、涂布棒、摇床等。

3 方法
3.1 染料脱色菌的筛选和纯化
染料脱色菌的富集：从求索溪中取适量污水，用无菌纱布过滤后取出10g，接入含150ml富集培养基的锥形瓶中，在37℃振荡条件培养2d后观察现象，取出颜色有明显变化的锥形瓶，进行下一步的实验。

菌种的分离筛选及纯化：在无菌条件下，用移液管从培养的锥形瓶中吸取
0.2ml菌液，将其移至加有孔雀石绿的脱色培养基培养皿上，在37℃恒温培养箱中培养1d后，待菌落长出后，拍照。

以脱色圈大小、菌落大小作为指标，初步筛选出有效菌株，选取长势好、菌落下培养基脱色圈明显的菌落，用接种环挑取菌落接种至倒好的斜面培养基上，放入37℃恒温培养箱中培养，进行纯化。

3.2 染料脱色菌生长曲线的测定
采用比浊法测定菌株的生长曲线，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出菌株在30℃液体培养下的生长曲线。

测定菌株的生长曲线具体步骤如下：
(1)种子液制备。

取斜面菌种各1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入无菌牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃震荡培养18h作种子培养液。

(2)标记编号。

取盛有10ml无菌牛肉膏蛋白胨培养液的试管，在每支上分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14h 。

(3)接种培养。

用1ml无菌吸管分别准确吸取0.2ml种子液加入已编号的试管中，于30℃下振荡培养。

然后分别按对应时间将试管取出，立即放4℃冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。

(4)生长量测定。

将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长，分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h 起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

(5)绘制生长曲线。

记录测定的各OD值，以上述时间标志为横坐标，相应的OD（600nm）值为纵坐标，绘制菌种的生长曲线。

3.4 染料脱色菌脱色能力的测定
将分离纯化的菌株分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150r/min 振荡培养24h。

取新鲜制备的菌悬液5mL，加入到含100ml脱色培养基的锥形瓶中，
然后在37℃，150r/min震荡条件下的摇床中持续培养48小时后取样，将离心机设置为10000prm离心5分钟，取上清液在染料的最大吸收峰处测吸光度值，并以不加菌的脱色培养基为对照，计算脱色率。

以脱色率的大小来表示菌种对染料的脱色能力。

脱色率：（A﹣B）/A×100%
式中，A——不加菌液的吸光度值
B——t时间后的接菌液的吸光度值
4 实验结果
4.1 生长情况
现象：菌落呈圆形斑点状，乳白色，数量为几个，菌落周围颜色明显变浅甚至成为浅白色。

图片：
（加孔雀石绿的脱色培养基的培养图）
4.2 染料脱色菌生长曲线的测定
不同培养时间菌液在600nm 波长下的OD 值表时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14 OD 值 0.419 0.472 0.513 0.584 0.615 0.596 0.506 0.449 脱色菌生长曲线
4.3 染料脱色菌脱色能力的测定
现象：加菌液后的有孔雀石绿的培养基变为浅绿色，浑浊，而未加菌液的培养基依然为较深的绿色，两者差别很明显。

图片：
（说明：图中左边为加了菌液的锥形瓶，右边则为未加菌液的锥形瓶。

）
脱色菌生长曲线
0246810121400.1
0.2
0.3
0.40.50.60.7051015
时间/h O D 值系列1
两种菌液在600nm波长下的OD值表
培养基
OD值
平均OD值1号2号3号
不加菌液 1.695 1.735 1.718 1.716 加菌液0.132 0.137 0.125 0.131
脱色率=（1.716-0.131）/1.716*100%=92.37%
5 分析及讨论
（1）脱色菌在培养之初一直在增长，说明已经度过了适应期，但不是成对数增长，说明培养基某种条件（如PH值，C/N等）还不是很符合该种菌；从第6h进入稳定期，菌数量达到最大；从第10h进入衰亡期，数量开始减少，这可能是由于营养物质的减少、菌落中个体间的竞争或代谢过程中产生了有害物质。

（2）脱色菌的脱色效率达到92.37%，加入脱色菌使培养基颜色明显变浅，效果比较理想，可以作为治理含与孔雀石绿类似染料废水的理想菌种。

但若要投入实际应用，还要进行进一步的研究，探究出该菌的适应生长、繁殖条件，包括适宜的废水PH值，有机物C/N，温度，理想的COD、BOD值，进入稳定期需要的时间，以及它的生态效应等各种情况，再根据当地水体的具体情况投入实际应用。

6展望
从理论上讲，多种物理化学和生物方法都可以用于印染废水的处理，常用的物化处理工艺主要是混凝沉淀法、混凝气浮法、电解法、絮凝沉淀（气浮）、生物活性炭法和化学氧化法等，但这些方法费用相对较高，在我国目前的科技和经济状况下，普及推广上有一定的困难，不是很实际。

而生物方法有运转费用低，处理效果好，操作简单等优点，日益受到人们的重视，并在印染废水的处理中得到广泛应用。

本实验通过对染料脱色菌的富集、分离，驯化培养，脱色能力的测定以及生长曲线的测定，可以初步得出脱色菌的生长情况和生长条件，及其脱色效果，可以为将脱色菌投入治理染料废水的实际应用提供一定的借鉴。