高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus）是一种重要的食品、药用真菌，具有制作红曹和红曲色素的能力。
红曲霉色素是一种天然的食品着色剂，被广泛应用于食品加工和制药工业。
而红曲霉也是一种可以用于生物转化生产脂质和多糖等重要化合物的微生物。
红曲霉高产菌株的筛选及固态发酵研究对于提高红曲霉发酵产物的产量和质量具有重要意义。
一、红曲霉高产菌株筛选1. 优良菌株的选择红曲霉菌株的筛选是红曲生物技术研究的关键之一。
目前，常用的筛选方法是通过对菌株的培养条件、生理生化特性以及代谢产物等进行评价，从中选取表现出高产、高效、高稳定性的优良菌株。
在筛选过程中，需要考虑到不同菌株之间的遗传变异、发酵产物的生产能力等因素，综合评价后确定优良菌株。
2. 根据菌株代谢产物进行筛选红曲霉菌株具备多样的代谢产物，包括红曲素、黄酮素、黄酮甾醇和多糖等。
在筛选优良菌株时，可以通过检测这些代谢产物的合成能力，选择产量高、纯度高、质量好的优良菌株。
还可以采用高通量筛选技术，如基因组学、代谢组学和蛋白质组学等方法，加快筛选速度，提高筛选效率，为选取优良菌株提供科学依据。
3. 利用基因工程技术筛选优良菌株利用基因工程技术，可以对红曲霉的代谢途径进行调控和优化，从而提高其生产产物的能力。
通过转录组分析和基因功能鉴定，可以筛选出与产物合成相关的关键基因，并通过基因工程技术对这些基因进行改造、调控，从而提高产物的产量和质量。
二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵的基本原理固态发酵是指微生物在不同有机物基质中进行生长和代谢过程。
相比于液态发酵，固态发酵具有体系复杂、生物多样性丰富、营养物质丰富等优点。
对于红曲霉来说，固态发酵可以有效提高产物的产量和质量，加快生长速度，促进代谢物的生成，增强抗胁迫能力。
2. 固态发酵的工艺优化固态发酵的工艺优化是红曲霉生物技术研究的重中之重。
优化工艺可以从发酵基质的选择、培养基成分、发酵条件等方面入手，通过对各项参数进行调控和优化，提高红曲霉的产物产量和质量。
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
关键词 ： 色木霉 ； 绿 愈创 木酚 ； 态学特征 ； 形 酶活 力
中图 分 类 号 ：９ ５ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）３— ０ ０— ４ １０ ９３ （０ ８ ０ ０４ ０
刘 敏， 张 明
２ ０３ ） ３０６ （ 安徽 农 业 大学生命科 学 学院 ， 合肥
摘
要： 以愈创 木酚为底 物 ， 采用 平板 筛选法 筛选得到 一株 产漆酶 菌株 ＷＳ ． ， 态学特性表 明该 茵属 于绿 色木 １２ 形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明 ， Ｉ ＷＳ 一 ２菌株 的产 酶高峰期 出现在接 种培 养后 的第 ４ 。与蔗 糖、 糖、 乳糖 ｄ 乳 半 和 可溶性淀粉相 比， 以葡萄糖 为碳 源时， 发酵上清液 的漆 酶活力明显要 高， 大值 达 ２０ ／ 。 以 Ｎ １ 最 ３Ｕ Ｌ Ｈ Ｃ 为氮源 ， 最 有利 于 ＷＳ － １２漆酶的产生 ， 酶活力最高可达到 ２ ４ ／ 。００ ｍｎｌＬ的愈创木 酚和 Ａ Ｔ 漆 ３Ｕ Ｌ ， １ ｒ ／ ｏ Ｂ Ｓ对 ＷＳ － Ｉ２产漆 酶有明
明 ， － ｉ： ｈ ｎｍ ｎ＠ ａａ．ｄ ． ｎ Ｅｍａ ｚａｇ ｉｇ ｈｕ ｅｕ ｃ 。 ｌ
基金项 目： 安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（ 教秘人 １０４— ０ ） 【 ２０ １０
收 稿 日期 ：０７一 ４—２ ２０ ｏ ８
化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株 分别接种
到筛选平板上 和 Ｐ Ａ平板 上 ，８Ｃ恒 温培养 ， 出筛 Ｄ ２￣ 选 选平板上 出现明显 氧化变色圈 的菌 株 ， 通过 Ｐ Ａ平 并 Ｄ
漆酶高产菌株筛选及漆酶基因片段的克隆
Ｔｈ ａ ｃ ｆ Ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｏ ｇ ｌＬａ ｃ ｓ ｔ ａ ｎ ｅ Ｒｅ ｒ ｈ ｏ ｃ ｅ ｎｉ ｆ Ｆｕ ａ ｃ ａ ｅ Ｓ ｒ ｉ
同培 养 基 对 漆 酶 产 生 菌 株 筛 选 条 件 进 行 研 究 ， 过 氧 通
于 担 子 菌 、 知 菌 和 子 囊 菌 中 ， 中最 主 要 的 生 产 者 是 半 其
担 子 菌 。 。漆 酶 （ ｃａ ｅ ） 一 种 含 铜 的 多 酚 氧 化 ］ Ｌａｃ ｓｓ 是
酶 ， 与 真 菌 的 发 育 、 态 发 生 过 程 相 关 ， 与 孢 子 的 它 形 参
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｌａ ｃ ｓ ｒ ｄ ｃ ｉ ｎ ｓ ｒ ｉ ｎ ｕ ａ ｉ ｎ ｃ ｎ ｉｉ ｎ ｅ ｅ ｓ ｕ ｉ ｄ ｂ ｉｆ ｒ ｎｔ ｓ ｂｓ ｒ ｔ ｏ ｃ ｎ ｒ — ｓ ｒ ｃ ： ｃ ａ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔｏ ｔ ａ ｎ ｉ ｃ ｂ ｔｏ ｏ ｄ ｔｏ ｓ ｗ ｒ ｔ ｄ ｅ ｙ ｄ ｆ ｅ ｅ ｕ ｔ ａ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔ ａ
（ ． Ｃｏ ｌ ｇ ｆ Ｆｏ ｅ ｔ ｙ ｕ ｃ ｎ ｃ ｅ ｅ ｙ ｃ ｕ ， ５ ０ ０； １ ｌｅ ｅ ｏ ｒ ｓ ｒ ｏ ｒ ｅ ａ ｄ ｓ ｉｎｃ ， ｉ ｈ ｎ １ ３ ０
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白腐菌真菌漆酶对染料降解的研究
白腐菌真菌漆酶对染料降解的研究摘要：漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，常被称为对苯二酚的氧化酶。
本文讨论白腐菌产漆酶的过程，漆酶对靛蓝和金橙Ⅱ在脱色氧化降解方面的研究，从实验的数据我们得到：漆酶在氧化降解靛蓝时最适合的pH=4.5，最佳温度是30℃，用 3.9 IU/mL的漆酶来进行脱色降解反应时，420 min时脱色较完全，可以达90%；而漆酶氧化降解脱色金橙Ⅱ的适合的条件是pH=4.0，30℃，采用浓度为13.5 IU/mL 的漆酶处理含有金橙Ⅱ的溶液，反应达500min时，脱色较完全，可以达到90%以上。
关键词：白腐菌；漆酶；靛蓝；金橙Ⅱ；脱色降解引言漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，利用氧把对苯二酚（也叫氢醌）氧化后能生成对苯醌，也常被称为对苯二酚的氧化酶，一般存在于真菌和植物中[1][2]。
由于近代染料工业的快速发展，使得染料工业对环境的污染成为当前的重大课题[3]，而漆酶能在染料的降解方面具有独特的效果，当前成为环境处理的重点产业之一。
一、真菌漆酶的微生物生产（一）菌种、试剂仪器及培养基白腐菌（white rot fung NS8），南昌大学生命科学学院保藏。
2，2?-连氮-双（3-乙基并噻-6-磺酸）（ABTS）、2，5-二甲代苯胺（XYL），Sigma公司；其它试剂都为分析纯。
高压灭菌锅；摇床；冷冻离心机；UV-1800型紫外分光光度计。
（二）CPDA培养基综合培养基（又称cpda培养基）：马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B110毫克，琼脂18-20克，自来水1000毫升，pH5-6。
（三）菌种的筛选本文中白腐菌是从枯枝上采集而来，然后再进行白腐真菌的逐步筛选。
在实际方案中，为了提高筛选的效率，菌种筛选方案常常将筛选分为初筛和复筛两步完成[4] 。
1.产漆酶的初筛将采集来的枯枝，取其中的白色块状物，用无菌水来按不同浓度（102、103、104）进行稀释，而且平行做三次。
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus spp.）是一种能够产生红色素的真菌，广泛应用于米酒、食品着色和制取红曲米等工业生产中。
红曲霉高产菌株的筛选和固态发酵研究对于提高红曲霉的生产效率和产品质量具有重要意义。
本文将对红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究进行探讨。
一、红曲霉高产菌株筛选1. 红曲霉高产菌株的选择红曲霉高产菌株的筛选是通过将已有的红曲霉菌株进行筛选和培养，以获得具有高产色素和其他相关代谢产物的菌株。
通常采用的方法有：采用可溶性淀粉或葡萄糖等作为碳源，进行培养和发酵实验；在不同的培养条件下，如温度、pH值等条件下进行培养实验，通过检测发酵产物的数量和质量来筛选出高产菌株。
2. 分子生物学方法在高产菌株筛选中的应用随着分子生物学技术的发展，如PCR、基因克隆、基因表达等技术的应用，可以通过对红曲霉菌株进行基因分析，筛选出具有高产色素和其他相关代谢产物的菌株。
分子生物学方法不仅可以准确地鉴定菌株类型，还可以帮助筛选出更加适合工业生产的高产菌株。
3. 发酵产物分析通过对红曲霉菌株的培养和发酵产物的分析，可以鉴定出产色素和其他相关代谢产物的菌株。
通过对产物的数量和质量的测定和分析，可以筛选出高产菌株。
二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵培养基的优化固态发酵的培养基是影响红曲霉生长和代谢产物产生的重要因素。
常用的固态发酵培养基包括糯米、黄米、小麦等。
固态发酵培养基的优化可以通过调整碳源、氮源、微量元素和水分等因素，以提高红曲霉的生长和代谢产物的产量。
2. 发酵条件的优化在固态发酵过程中，温度、pH值、通气量等发酵条件对红曲霉的生长和代谢产物的产生有重要影响。
通过调整这些发酵条件，可以提高红曲霉的生产效率和产品质量。
3. 发酵产物的提取和分离固态发酵产生的红色素和其他相关代谢产物需要进行提取和分离。
常用的方法包括有机溶剂提取、分液柱色谱分离等。
通过这些方法，可以获取纯度较高的红色素和其他相关代谢产物。
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
高产β-葡聚糖酶菌株初步筛选与鉴定
１ － 试 剂 标准大麦 Ｂ 葡聚糖购 自 Ｓ ｍ 公 ．２ １ 一 ｉ ａ ｇ 司 ；－ ３ 葡聚糖 ，天津市光复精细化工研究所 ，纯度
９ ．％； 他试剂 均 为 Ａ ９９ 其 Ｒ级 或 Ｂ Ｒ级 商品试剂 。
１ ． 培养 基 （ ） ．３ １ １ 基本培养基 （ ０ Ｌ ： 白 ０ｍ ） 蛋 胨 １ ，牛肉膏 ０ ，琼脂 １ ， ａ １ ．，Ｈ值 ７ ， ． ０ ． ４ ． ＮＣ０ ｐ ８ ４ ． ２ １１ ２℃灭菌 ２ ｉ。 ２分离培养基（／ ０ｍ ）大麦 ５ｍｎ （ ） ｇ０ Ｌ ： ｌ Ｂ 葡 聚 糖 ０２ 刚 果 红 ００４ 琼 脂 １ ， Ｎ ３ ．， 一 ．， ． ， ０ ． Ｋ Ｏ １ ８ ０
摘 要 ： 利用 ３ 葡聚糖酶能够 降解 含刚果红染料 的高分 子量大麦 Ｂ 葡 聚糖 从而使培养基产生透 明圈 的特点 ， － 一 对采集 的土样进
行 了分离纯化 ，得到一株 高产 ｐ 葡聚糖 酶的菌株 并做 了初步鉴定 。结果表 明 ，筛选到 １ 高产 Ｂ 葡 聚糖 酶的菌株 ，命名 为 一 株 一
ｃ ｎａ ｎ ｎ ｎ ｏ ｒ ｄ ｄ ｅ ｔ ｒ ｄ ｃ ｒ ｎ ｐ ｒ ｎ ｉｃｅ ｔ ｅ ａ ａ ｅ ａ ｄ ｐ ｒｆ ｈ ｏｌ ｃｅ ｏｌｓ ｍｐ ｅ ， ｎ ｉｈ ｙｅｄ ｏ ｔｉ ｉ ｇ Ｃｏ ｇ ｅ ｙ ｏ ｐ ｏ ｕ ｅ ｔ ｓ ａ ｅ ｔ ｒ ｌ ｏ ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ｕ ｉ ｔ ｅ ｃ ｌ ｔｄ ｓ ｉ ａ ｌｓ ａ ｄ ａ ｈｇ — ｉｌ ａ ｃ ｙ ｅ ｓ ａ ｎ ｆ ｒ Ｂ ｇ ｕ ａ ａ ｅ ｗａ ｂ ａｎ ｄ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｅ ｒｌ ｎ ｒ ｙ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅ ｓ ｒ ｅ ｅ ｉｈ ｙｅｄ ｓｒ ｉ ｔ ｉ ｏ — ｌ ｃ ｎ ｓ ｓ ｏ ｔ ｉｅ ｎ ｄ ｎ ｉ ｄ ｐ ｅ ｉ ａ ｉ ． ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｃ ｅ ｎ ｄ ｈ ｇ － ｉｌ ｔ ｎ ｒ ｉ ｆ ｍｉ ｌ ｓ ａ
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高产漆酶菌株的筛选及对染料的降解
高产漆酶菌株的筛选是指在自然环境中寻找出能够高效产生漆酶的菌株。
常规的筛选方法包括培养物染色法、营养物变质法、纸板涂片法等。
其中，培养物染色法是最常见的筛选方法，通过将待筛选菌株培养在含有染料的培养基上，观察染色变化来筛选出具有高产漆酶能力的菌株。
营养物变质法则是通过使用染料作为唯一碳源进行培养，筛选出能够利用染料作为唯一碳源并高效降解染料的菌株。
纸板涂片法是通过将待筛选菌株涂片于含有染料的纸板上，观察菌落生长和染料降解情况来筛选高产漆酶菌株。
高产漆酶菌株对染料的降解是指这些菌株能够将染料分子降解为无害的物质或将其转化为可再利用的物质。
漆酶是一种特殊的氧化酶，具有广谱的染料降解能力。
菌株通过产生漆酶来降解染料，漆酶可以在染料分子中引入氧原子，使得染料分子发生氧化反应，降解为低分子化合物。
高产漆酶菌株对染料的降解能力通常会通过测定漆酶活性、测定染料降解率等指标来评估。
降解染料可以有效地减少染料对环境的污染，这对环境保护和可持续发展具有重要意义。