PNH 睡眠性阵发性血红蛋白尿

PNH睡眠性阵发性血红蛋白尿Clinical Review睡眠性阵发性血红蛋白尿PNH睡眠性阵发性血红蛋白尿（PNH）是一种获得性造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、慢性溶血性贫血急性发作。

PNH的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。

PNH 的临床表现不一，疾病进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。

最近15年，在PNH的细胞和分子生物学研究中取得了重要进展，定义了导致PNH异常表现的分子缺陷。

而使用流式细胞仪进行PNH 诊断分型，是PNH研究的又一里程碑。

历史回顾Strubing早在一个世纪之前，就第一次报告了PNH，症状为溶血性贫血，伴有夜间血红蛋白尿。

50年后，Ham和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham 实验，用来诊断PNH。

不久，又发现PNH 的溶血是由于患者的红细胞对补体敏感。

进而又发现PNH患者的中性粒细胞和血小板也有异常。

Dacie在1963年提出了PNH是由于干细胞突变造成的获得性克隆异常的假说。

后来，通过对两位患有PNH的妇女的异构酶葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究，证实了这一假说。

PNH红细胞中只含有一种异构酶，而病人正常红细胞中含有两种异构酶。

·生化缺陷1983年，PNH红细胞的生化研究表明，PNH缺乏一种被称为延迟加速因子DAF的补体调控蛋白。

这种蛋白抑制补体C3转换酶的形成，并通过glycophosphatidylinositol （GPI）的锚定作用（翻译后处理步骤）固定在细胞膜上。

进一步研究表明，PNH细胞缺少这种通过GPI与细胞膜的正常连接。

这意味着，GPI锚定蛋白的合成异常，是PNH 的起因。

PNH细胞系的GPI合成的生化通路也异常，这种异常发生在通路的第一阶段的N-acetylglucosamine到phosphatidylinositol的转移过程中。

·分子缺陷1993年Miyata等发现了PHN的基因缺陷。

通过对一系列复杂的补体和转染研究，证实了PNH细胞系的phosphatidylinositol glycan complementation class A（pig-a）基因表达了错误的GPI相关的抗原。

对pig-a基因进行序列分析，发现迄今为止，所有报导过的PNH病人都有pig-a基因的突变。

由于这种突变发生在体细胞，所以表现不一致，并且在整个pig-a编码区域中，都有发生突变的可能。

这些突变包括缺失、插入和点突变。

所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二个），导致漂移突变，产生了无功能产物。

漂移突变导致了细胞完全缺乏GPI锚蛋白（III类细胞）。

另一部分突变是点突变，保留部分活性，可以合成少部分的GPI锚蛋白。

这种突变细胞表达部分GPI锚蛋白（II类细胞）。

由于pig-a基因位于X染色体，每个细胞只有一个功能性pig-a基因（女性X染色体失活），因此，单一突变会造成GPI缺失表型。

相反，每个细胞中都有两个具有活性的常染色体pig基因，只有常染色体上两个等位基因都发生突变，才会产生PNH症状。

·流式细胞仪分析使用分子生物学已经成功发现了PNH 的基因缺陷，而使用单克隆抗体和流式细胞仪技术则是发现诊断PNH表型异常的重要手段，具有同样的重要意义。

1985年，两个各自独立的小组使用流式细胞仪和DAF （CD55）抗体，调查PNH患者，发现了缺乏DAF的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板。

这都证明PNH的多系特征，有力支持PHN是克隆性干细胞疾病的学说。

进一步分析PNH病人骨髓造血干细胞，发现也缺乏DAF的表达。

之后，随着新的GPI锚蛋白单克隆抗体的出现，PNH的研究又进一步深入。

Van der Schoot等发现PNH患者中性粒细胞缺乏CD16、CD24和CD67（后来有更名为CD66b）。

同时，他们第一次证明在PNH诊断中，流式细胞仪检测优于Ham实验。

在研究中，他们分析了16例再生障碍性贫血的病人，在3例病人的粒细胞中发现了少量PNH克隆，而这3例病人Ham实验均阴性。

后来有人又进一步证实了一些严重再生障碍性贫血的病人有GPI缺乏的粒细胞和单核细胞，而红细胞可以正常。

于是，流式细胞仪诊断PNH的可靠方法很快建立起来，同时，还用来判断PNH的疾病程度和PNH克隆的造血细胞系别来源。

现在，尽管目前使用的流式细胞仪检测技术在方法学和抗体选择上还没有统一，但它已经取代了Ham实验，成为了PNH诊断的"金标准"。

使用流式细胞仪可以发现Ham实验阴性的再生障碍性贫血病人中存在的少量PNH细胞，这可以将PNH分为两种情况：（1）溶血性PNH，特征是显性溶血性贫血，同时有血红蛋白尿。

值得注意的是，这组病人中，有50%发生静脉血栓，这是导致病人死亡的主要原因。

（2）再生不良性PNH，可以检出GPI缺乏的造血细胞，没有显性溶血，但可能有其它症状，如再生障碍性贫血、白细胞减少症或血小板减少症。

这组病人中，有10%死于再生障碍性贫血。

很多病人由于同时具有以上两组的症状，而不能单纯分类归于某一组。

有一部分病人有再生不良性PNH，然后进展为溶血性PNH。

另一小部分病人--但在临床上很重要--首先就有血栓形成，临床上却没有溶血症状。

而且，发现及少数病人有先天性（非pig-a 突变）GPI缺乏。

一些研究小组也报导了Budd-Chiari综合症（肝静脉栓塞）病人伴有PNH高发。

很明显，遇到病人血栓形成（如肝静脉和脑静脉）无法解释时，应该排除PNH的可能。

PNH的实验室诊断·基于红细胞补体敏感性的实验在有流式细胞术之前，PNH检查主要依靠溶血实验。

Ham实验、蔗糖溶血实验和改进的Ham实验的原理是：PNH红细胞对溶血的敏感性与正常细胞不同。

这些实验虽然对溶血性PNH有效，但既不能有效检测出PNH红细胞含量少的样本，也不能区分部分缺失和完全缺失的细胞。

另外，由于输血原因，且PNH红细胞的寿命较短，以上这些实验都不能对PNH克隆给予准确判断。

研究表明，通过流式细胞仪分析发现GPI缺乏的中性粒细胞，可以更加准确地判断PNH 克隆的情况。

Ross及其同事于1906年代创建了补体溶血敏感实验（CLS），这个实验可以对PNH红细胞的类型和比例给予更准确的判断。

但是，CLS实验及费时费力，难于操作，不适合常规诊断。

近来又改进方法，发展了DiaMed单克隆抗体胶技术，用于PNH筛查，它克服了一些CLS方法的技术难点。

这一方法可以在血液病实验室常规使用，但是与流式细胞仪方法比较，其灵敏度、特异性都要差一些。

而且DiaMed方法仍然需要做大量的临床实验，来验证方法的可靠性。

·流式细胞仪使用流式细胞仪分析血细胞GPI锚蛋白，需要考虑设门的策略和抗体的选择。

而且，对于PNH检测的结果的解释，有赖于对GPI相关抗原在细胞上的分布和在造血细胞分化的不同阶段有不同表达（见下表）的相关知识的了解。

用流式细胞仪检测PNH，并不是说在PNH细胞上，所有的诊断用抗原全都不表达。

因此，应该所有细胞类型上筛查至少两种GPI抗原，以排除先天性单一抗原缺乏的可能，同时排除技术原因造成的误差。

另外，应该使用跨膜抗原检测做为阳性对照。

抗原功能细胞分布CD14 内毒素受体（脂多糖受体）单核细胞高表达，粒细胞弱表达CD16 低亲和力Fc受体中性粒细胞、NK 细胞和T淋巴细胞CD24 不详B淋巴细胞和粒细胞CD48 可能是与CD2结合的受体/配体淋巴细胞和单核细胞CD52 (CAMPATH) 不详淋巴细胞和单核细胞CD55 (DAF）补体调控；限制C3转化酶的合成所有造血细胞CD58 (LFA-3) 细胞黏附；免疫反应的共刺激信号所有造血细胞CD59 (MIRL) 抑制膜攻击复合物的合成，并保护细胞不发生补体介导的溶血反应所有造血细胞；在非造血细胞中也有广泛表达CD66b 细胞黏附；细胞活化粒细胞；上皮细胞CD66cCD66e (癌胚抗原)CD73(ecto-5-核酸酶) 免疫调控B和T淋巴细胞亚群CD87 (uPAR) 将纤溶酶原转化为纤溶酶T 淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、中性粒细胞和非造血细胞CD90 (Thy-1) 不详干细胞亚群；小T淋巴细胞亚群CD108 可能参与细胞黏附红细胞；淋巴细胞低表达CD109 不详活化的T淋巴细胞、血小板、巨噬细胞和CD34+干细胞亚群CD157 Ecto-酶；ADP核糖水解酶环化酶骨髓基质细胞、单核细胞和粒细胞红细胞分析：早期的研究检测集中在红细胞GPI相关抗原的表达上。

原因有二。

第一，疾病主要的临床症状是溶血。

第二，以往的PNH筛查实验，如Ham实验和蔗糖溶血实验，是红细胞检查。

PNH以前属于于获得性溶血性贫血，但是现在发现是属于干细胞异常。

尽管目前还没有一致的设门策略，我们倾向于前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）使用对数放大模式，并根据红细胞的物理特性，FSC/SSC设门。

同时，检测一个已知在所有红细胞上都表达的非GPI 相关的糖蛋白抗原，计算阳性百分率，用来判断FSC/SSC设门的纯度。

与分析淋巴细胞、白细胞或干细胞的Boolean设门策略相比，这种设门方法不够理想。

在做红细胞多色分析时，应该考虑红细胞聚集造成的影响。

细胞洗液和单抗试剂中有少量蛋白成分，容易使结合了抗体的红细胞发生聚集。

因此，我们选择做单色分析。

在PNH红细胞常规筛查实验中，建议使用直标抗体，检测两种GPI相关抗原--CD55和CD59。

如果检测到阴性或部分缺失的细胞，一定是两种GPI相关抗原同时缺失，才可以诊断PNH。

这是因为，有一些少见的遗传性缺失的病人可以缺少CD55或CD59之一。

分析未输血的PNH病人，发现细胞可以明显分为三种类型：III型细胞（完全缺失）、II型细胞（部分缺失）和I型细胞（正常表达）。

不同病人的三型细胞的Mark设定可能会有所不同，有时三群细胞可能不能清楚地分开。

大多数PNH病人的粒细胞异常克隆比例大于红细胞异常克隆。

这是由于与正常红细胞相比，PNH红细胞的寿命较短，且输血后，比例减少。

近年来的研究表明，III型红细胞的寿命为17-60天，II型红细胞（CD59至少为正常细胞表达量的15%）可以较少产生补体介导的溶血反应。

有趣的是，使用噻唑橙和CD59分析PNH患者的网织红细胞，发现PNH网织红细胞的比例与中性粒细胞克隆的比例相近。

这说明，在PNH中，红细胞和中性粒细胞的骨髓前体具有相似的增殖能力，检测PNH患者的网织红细胞可以提供有关红细胞生成率的重要信息。

很显然，未来的流式细胞仪检测趋势是利用物理信号和荧光信号，建立一个更加有效的红细胞设门策略。

粒细胞分析：以前对PNH粒细胞的研究主要是FSC/SSC设门的单色或双色研究。