多克隆抗体技术
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。
4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。
5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。
6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。
7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。
9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。
10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。
11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。
需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。
以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。
多克隆抗体的原理及制作方法
多克隆抗体的原理及制作方法一、原理多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。
外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。
初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。
但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。
由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。
记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。
本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。
该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料（一）动物选择根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。
动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。
家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。
每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没有明显的损伤。
（二）抗原制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。
常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。
一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。
有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。
多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)
多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。
免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。
本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。
抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。
以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。
佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。
常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。
注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。
血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。
多克隆抗体
多克隆抗体多克隆抗体: 原理、应用和优势摘要：多克隆抗体是一种可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗的重要工具。
本文将介绍多克隆抗体的原理、应用和优势，帮助读者更好地了解和使用多克隆抗体。
1. 引言多克隆抗体是由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体群体。
相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有多种来源细胞、多样性抗体特异性和高抗原亲和力的优势。
2. 多克隆抗体的原理多克隆抗体的制备需要经历免疫原注射、免疫细胞制备、抗体筛选和克隆扩增等步骤。
通过注射抗原刺激机体免疫系统，激发B细胞产生特异性抗体。
然后通过细胞融合技术或酶消化法获得抗体产生的细胞系，最后经过筛选和扩增获得多克隆抗体。
3. 多克隆抗体的应用多克隆抗体在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域具有重要应用价值。
在科研中，多克隆抗体可用于蛋白质表达分析、免疫组化染色、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等实验技术。
在临床诊断中，多克隆抗体可用于检测病原体感染、肿瘤标志物和药物浓度。
此外，多克隆抗体还可应用于治疗，如癌症免疫治疗和抗体药物研发。
4. 多克隆抗体的优势相比于单克隆抗体，多克隆抗体具有以下几个优势：4.1 多源性：多克隆抗体通过多个细胞克隆产生，能够识别抗原上的多个不同部位，从而提高抗体的特异性和亲和力。
4.2 可灵敏性：多克隆抗体可以通过融合多个细胞系来增加抗体的生产量，提高实验的灵敏性和可靠性。
4.3 高特异性：多克隆抗体可识别抗原上多个不同的表位，在检测复杂样本中具有更高的特异性。
4.4 宽适应性：多克隆抗体对于不同类型的抗原具有较强的适应性，可以应用于多种研究领域和技术平台。
5. 多克隆抗体的挑战与优势相对应的是多克隆抗体也存在一些挑战。
制备多克隆抗体需要免疫动物，然后通过脾细胞和骨髓细胞等制备免疫细胞，这个过程较为复杂且不易实施。
此外，多克隆抗体的批次间差异性较大，因此需要进行一定的筛选和验证工作。
6. 结论多克隆抗体作为一种重要的实验工具，在生物医学研究、生物工程和医学诊断等领域发挥着重要作用。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
9、多克隆抗体的制备
（二）血清的分离
采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固， 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。 先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次 日离心收集血清。 采血量大时，用自然凝固加压法 无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品 库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体 （高免血清）制备技术
一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛 奶抗体等
高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗 血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素
产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋 黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预 防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。 卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较 高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物 连续生产的优点。 有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。
七、血液采集与血清提取
按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验 （试血），血清效价达到合格标准时，即可 采血。
不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者 淘汰。
（一）采血次数和方法
效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。
采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血 脂过高。
多克隆抗体制备的技术_PPT幻灯片
• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•
电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
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第九章多克隆抗体技术（Polyclone antibodies preparation technique）一、概述（一）多克隆抗体的概念抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。
（二）免疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。
动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。
如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的，而且千差万别。
就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。
为了• 1 •获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA 文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。
不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。
剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。
在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。
蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。
一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。
加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。
加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。
如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。
如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。
免疫周期长者，可少量多次。
免疫周期短者，应大量少次。
两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。
一般间隔时间应为5~7天，加佐剂者应为2周左右。
注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
（四）佐剂的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。
也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。
⑴弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）羊毛脂 1 份石蜡油 5 份混合，高压灭菌后保存。
用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。
⑵弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）弗氏不完全佐剂10ml卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min灭活处理。
• 2 •初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。
再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。
但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。
⑶脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。
⑷油佐剂：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。
目前应用最广的矿物油。
10号白油(石蜡油) 100ml硬脂酸铝2g司本80 6ml混合加热融化，分装。
用时按下列配方进行乳化。
油相3份水相（加4%吐温－80）1份先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。
司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于乳化。
2．乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。
乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。
少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。
当大量乳化时，可采用胶体磨进行。
乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。
如出现平展扩散即为未乳化好。
乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。
根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。
抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。
注射间隔时间带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4周免疫一次。
不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右的间隔时间。
可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。
• 3 •（六）抗体的鉴定1.抗体的效价鉴定不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价。
不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。
鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。
常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法，以资比较。
如制备抗抗体的效价，一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2.抗体的特异性鉴定抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。
抗体的特异性高，它的识别能力就强。
衡量特异性通常以交叉反应率来表示。
交叉反应率可用竞争抑制试验测定。
以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管，而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时，表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0，即该血清的特异性较好。
3.抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。
亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。
有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。
亲和力常以亲和常数K表示，K的单位是L/mol，通常K 的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。
抗体亲和力的测定对抗体的筛选，确定抗体的用途，验证抗体的均一性等均有重要意义。
（七）抗血清的冻存抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。
注意避免反复冻融。
也可将抗血清冷冻干燥后保存。
二、抗Ig抗体的制备（一）抗原制备Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产• 4 •生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
（二）材料与试剂1．提取的动物Ig2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物兔5．其它材料及试剂（三）操作方法1．免疫方法可以采用以下各种方法之一进行免疫。
（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg （每侧约0.30ml）。
7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml)；③必要时，14天后，重复步骤②一次；④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳静脉采血。
测定血清效价。
（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml （IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.50ml；③7～10天后，脊柱两侧重复注射一次；④7～10天后试血。
不合格者重复步骤③。
（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含完全佐剂抗原0.50ml （IgG量为5mg/ml）；②14天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原；③7天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml；④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增IgG量。
2．效价测定采用琼脂扩散法。
⑴将血清倍比稀释，加入外周孔。
⑵中间孔加动物Ig。
⑶37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。
（四）结果判定1．抗Ig的效价测定琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。
2．纯度鉴定采用琼扩法。
中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。
在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。
• 5 •三、猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联血清的制备（一）材料及试剂1．猪瘟疫苗2．猪丹毒菌苗3．猪肺疫疫苗4．肥猪（二）操作方法1．基础免疫选健康的育肥猪数头，进行猪瘟、猪丹毒和猪肺疫三种疫苗的基础免疫。
猪瘟疫苗采取肌肉注射法，猪丹毒和猪肺疫采用口服法进行。
2．加强免疫基础免疫后7~10天，进行加强免疫。
猪瘟疫苗、猪丹毒和猪肺疫菌苗分别为200头份、100头份和100头份，肌肉或皮下注射。
3．7天后，进行第二次强化注射，剂量同前。
4．10～12天后，无菌放血和收集血液。
放血前一天晚上停食，可饮水。
5．血液自然凝固、分离血清。