扩增活化的自体淋巴细胞技术
自体免疫免疫细胞治疗技术之CIK细胞治疗癌症_陈怡
329BIOTECHWORLD 生物技术世界CIK细胞具有增殖快速、杀癌力强、杀癌谱广、对正常细胞无杀伤作用、对耐药肿瘤敏感、可调整人体的免疫状态、刺激骨髓造血等重要作用。
是目前已知活性最高的非特异性杀伤免疫效应细胞。
树突状细胞(dendritic cell,DC细胞)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，也是唯一能激活幼稚T细胞的抗原的递呈细胞。
DC细胞在免疫应答过程中具有关键的作用。
将CIK细胞和同源DC细胞以及一系列细胞因子如IL-1、IL-2、IFN-y、CD3mAb共同培养，即可获得DC-CIK细胞。
它既可以促进DC细胞的成熟，更能促进CIK细胞的增殖，并增强其抗肿瘤活性。
1. CIK 细胞治疗技术流程白细胞采集→淋巴细胞→CIK细胞＋DC细胞＋细胞因子→共培养、添加IL-2扩增→DC-CIK细胞→质量检测→质量合格→静脉回输入患者体内→疗效评估2. CIK 细胞的抗肿瘤机制CIK细胞是一种异质细胞，是混合的细胞群体。
主要细胞成分为CD3+CD56+细胞，主要的效应细胞是CD3+CD8+细胞。
外周血单核细胞经多种细胞因子如IL-1、IL-2、IFN-y、CD3mAb等刺激诱导，并通过体外培养两周左右，细胞数量便可扩增上千倍。
其中CD3+CD56+CIK细胞达到70%以上，这是抗肿瘤作用的主要细胞亚群。
并且在回输到患者体内后，经细胞因子IL-2的诱导仍能进行扩增，这种机能保证了患者体内免疫细胞的数量和活性。
CIK细胞作用于肿瘤细胞主要有5种途径:(1)引发毒性颗粒依赖性溶细胞作用，致使靶细胞死亡。
(2)CIK细胞与T细胞抗原受体结合，参与免疫过程。
T细胞合成并释放毒性颗粒，作用于靶细胞，造成靶细胞溶解。
(3)CIK细胞自身可分泌细胞因子。
细胞因子作用于靶细胞或反作用于效应细胞，提高其活性。
(4)C I K 细胞群中的CD3+CD56+可以合成并释放穿孔蛋白，溶解靶细胞。
(5)CIK细胞能够激活靶细胞的凋亡基因，使凋亡基因转录并表达。
新型技术“T细胞活化技术”
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。
在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。
T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。
T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。
这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
图1-1 T细胞表面受体T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞（Thymus-dependent lymphocyte），简称T细胞。
T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。
T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。
T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。
图1-2 促进T细胞分化T细胞活化的标志应该是得到两个活化信号活化信号1是T细胞受体TCR与相应的抗原肽-MHC分子结合这里要注意，CD4+细胞是与抗原肽-MHC II类分子结合CD8+细胞与抗原肽-MHC I类分子结合CD4/CD8是TCR的辅助受体，也存在于T细胞表面结合后TCR-CD3复合体有了信号传导的能力CD3复合体的肽链胞浆区内含有ITAM（免疫受体酪氨酸活化基序），ITAM可以把活化的信号传导至细胞内部，至此得到活化信号1只有活化信号1还不可以使T细胞活化，这时需要活化信号2活化信号2就是由细胞表面的黏附分子来完成的对于T细胞来说，CD28是产生活化信号的共刺激分子，它与与此T细胞接触的APC(抗原呈递细胞）表面的B7分子结合后，即可产正活化信号此为第二活化信号需要说明的是，如果CD152与B7结合，产生的却是抑制信号，因为CD152胞内区含有ITIM（受体酪氨酸抑制基序）。
EAAL讲解附件-孙彦波
流
程
7. 回输：实验室提供质量检测报告，负责医生签署接收报告和细胞 ，护士用输血器进行细胞回输
取血要求（1）
•
•
取血前必需进行的医院检验科检查项目（取 血前3天内结果有效）：
血常规: (检查后及取血前无其它治疗)
– 决定病人是否可以取血
• 决定取血量
– 取血量=80ml/淋巴细胞绝对值 – 例如：患者淋巴细胞绝对值为1.2，取血量=80ml/1.2=67ml ，一般取70ml。
注射渠道 组别 G1 G2 G3 G4 G5 阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组 微静脉 微静脉 微静脉 微静脉 腹腔
注射剂量 (细胞数/只) 0 1.7 × 105 5 × 105 15 × 105 2 mg/kg
注射液 量 (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 10 ml/kg
操 作
3. 获得患者感染筛查和血常规结果（淋巴细胞绝对值）
4. 收费
5. 采血：取血量=80ml/淋巴细胞绝对值。实验室提供采血管，护士 采血
6. 细胞培养：实验室
1. 实验室以E-MAIL形式，在细胞培养开始约7-9天确认治疗方案中细胞 回输的日期 2. 实验室在每周四或星期五以E-MAIL形式和电话形式通知负责医生下 周患者回输日期和时间
EAAL作用机制研究
• EAAL细胞可通过多种途径杀伤肿瘤细胞：
1)以不同的机制识别肿瘤细胞,通过穿孔素等作用，穿透封闭 的肿瘤细胞膜，实现对肿瘤细胞的裂解，使其凋亡。见图1
图1 回输的EAAL细胞通过血管到达肿瘤部位，识别肿瘤细胞，通过穿孔素突破肿瘤细胞膜，进而杀死肿瘤 细胞。
EAAL作用机制研究
EAAL治疗的安全性
• 技术安全：EAAL细胞疗法运用独特的免疫细胞培养系统 ，完全避免了由于使用人或动物血清所可能引起的潜在 微生物感染隐患。 • 硬件安全：EAAL自体免疫细胞治疗技术配有国际先进的 整体万级、局部百级洁净、并符合国家GMP规范的免疫
肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术：技术优势、风险与几大应用场景
肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术：技术优势、风险与几大应用场景动脉网2018-10-04 11:36:35一、CAR-T技术原理（一）过继性细胞治疗过继性细胞治疗是细胞的免疫治疗一个主要研究方向。
过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。
在恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是常用的ACT治疗。
TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在IL-2等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。
然而，多数情况下无法应用TIL：有些患者缺乏肿瘤标本或肿瘤和转移灶中TIL很少；获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL 具有难度；回输的TIL 细胞功能受损，在体内往往不能有效识别肿瘤细胞; 肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力。
这些问题限制了TIL的广泛应用，仅对如恶性黑色素瘤和肾细胞癌的少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。
在这种情况下，ACT需要使用外周血淋巴细胞。
目前使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells, CD3-AK cells）等。
然而CIK等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。
在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor, TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞（TCR-T）或CAR-T细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。
一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]
![一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/736d7e3691c69ec3d5bbfd0a79563c1ec4dad755.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路88号(72)发明人 王冶陶 吴忠福 彭昉 刘慧显 王俊俊 俞英豪 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。
所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19C N 107177548A1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
过继免疫细胞治疗基础篇-6细胞产品
SOCS1 SOCS1
IRAK TRAF6 I B p50 RelA
IKK IKK IKK
节作用，限制抗原呈递的时间和强度，
从而限制自体抗肿瘤免疫反应。 该研究第一次提出了抑制免疫负调控 因子来增强DC疫苗的概念
Nature Biotechnol. 2004; 22:1521-2
四、AIL细胞
扩增活化的自体淋巴细胞（Autologou s Immunotherapy Lymphocytes,AI L），又称为高效CIK细胞。 是从患 者自体外周血（50-100ml）中分离单 个核细胞，经过体外激活扩增培养，得
到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细
胞的细胞群，主要效应细胞包括MHC限 制性效应细胞（CD3+CD8+细胞毒性T 细胞、CD3+CD4+辅助性T细胞）、非
肿瘤相关抗原 (tumor-associated antigen , TAA)
• intracellular Survivin (T cells) • surface MUC1 (T cells and Ab)
分泌型FliC: TLR5 ligand
• auto- and paracrine activation of APCs (enhanced Signals 2/3)
iAPA-细胞
七、CTL细胞
CTL(Cytotoxic T Lymp
hocyte)，细胞毒性T细胞，
其表面标志是CD8。这些细胞 的功能就像一个“杀手”，它
们可以直接攻击带有特殊抗原
的靶细胞，在抗病毒感染和抗 肿瘤免疫中具有极其重要的用，
细胞毒性T细胞也被称为杀手
细胞免疫疗法
机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等，它们本身就能够对抗肿瘤细胞的产生。
根据实验观察，一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞对付它。
而一立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。
因此，如果有大量的淋巴细胞，就能够有效的消灭肿瘤细胞，对抗肿瘤细胞的生成，这就是细胞免疫疗法的基本理念。
[1]简介机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等，它们本身就能够对抗肿瘤细胞的产生。
根据实验观察，一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞对付它。
而一立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。
因此，如果有大量的淋巴细胞，就能够有效的消灭肿瘤细胞，对抗肿瘤细胞的生成，这就是细胞免疫疗法的基本理念。
当前，以细胞免疫疗法为首的细胞生物治疗己经初露锋芒，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。
细胞免疫疗法，其全称为过继性免疫细胞疗法，(adoptive cellular immunotherapy, ACI或AIT)，是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性和非特异性的)，直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。
临床上是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞的一种治疗方式。
近年来，细胞免疫疗法一直是肿瘤生物治疗中最活跃的领域。
细胞免疫疗法对细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损伤免疫细胞数量及功能的患者，尤其是血液/免疫系统肿瘤的患者更为适合。
发展细胞免疫治疗可选择性地抑制/杀伤肿瘤细胞,而且不依赖于荷瘤者的免疫功能,并可与放、化疗合用,自上世纪80年代以来已进行了大量研究。
该疗法历经LAK、TIL、CD3AK、CIK、DC-CIK、EAAL等发展阶段，其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。
分类LAK细胞免疫治疗LAK细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞。
将外周血淋巴细胞在体外经淋巴因子白介素-2(IL-2)激活3～5天而扩增为具有广谱抗瘤作用的杀伤细胞。
自体免疫细胞(T细胞、NK)治疗技术管理规范
自体免疫细胞（T细胞、NK细胞）治疗技术管理规范国家卫生部医政处第三类技术准入制管理免疫细胞治疗技术是使用体外培养获得免疫活性细胞作为治疗手段的医疗技术。
本管理规范适用于在临床上已完成安全性和有效性认证，并符合伦理要求，只涉及T细胞和NK细胞作为治疗手段的医疗技术。
这类新技术已在世界多个国家开展，目前基本处于临床试验阶段。
为规范细胞免疫治疗技术临床应用，保证医疗质量，保障人体健康，保障公民的合法权益，并促进我国相关生物治疗技术的发展，特制定本规范。
第一部分自体免疫细胞治疗技术的范畴自体免疫细胞治疗技术：从自体外周血中分离的单个核细胞经过体外激活和扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。
这类细胞免疫治疗技术主要包括：一. 自体CIK细胞（自体细胞因子诱导的杀伤细胞）二. 自体TIL细胞（自体肿瘤浸润淋巴细胞）三. 自体DC-CIK细胞（自体树突状细胞刺激的CIK细胞）四. 自体CTL细胞（细胞毒T淋巴细胞）五. 自体γδT细胞（自体伽马德尔塔T细胞）六. 自体NK细胞（自然杀伤细胞）第二部分自体免疫细胞治疗技术临床应用机构要求一、临床应用机构基本要求（一）开展自体免疫细胞治疗技术应当与该医疗机构功能、任务相适应。
（二）具有卫生部门核准登记的三级甲等医院或省级及省级以上专科医院。
（三）具有与免疫细胞治疗相关的科室。
科室人员组成包括有从事人体免疫细胞治疗相适应的执业医师、执业护士、具有免疫学专业背景的专家和免疫细胞制备技术人员。
该科室职责包括接受体细胞免疫治疗患者的选择，治疗方案的制定，患者的管理和随访，疗效评估体系的建立，规范治疗的程序建立，以及在治疗过程中处理可能出现的问题等。
具备从事体细胞治疗质量控制的专业检验科室和人员。
（四）具有人体免疫细胞治疗所需要的场地、设备和设施。
（五）医院设有管理规范、运作正常的临床伦理委员会，该委员会中从事人体细胞免疫治疗的相关人员不超过委员人数的1/4。
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A2-03
0.32 2.3 7.19 0.1 0.51 5.10 0.07 0.36 5.14 0.23 0.48 2.09 0.78 8.7 11.15 0.22 0.31 1.41 0.66 10.01
15.17 12
EAAL在裸鼠体内 对HepG2形成肿瘤的抑制作用
裸鼠注射EAAL细胞的剂量分组
2
如何达到有效的免疫治疗效果
• 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞 • 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能
– Th1/Th2 – Treg
• 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部
– T 细胞归巢
• 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能
– 肿瘤基质及肿瘤组织微环境
3
肿瘤的免疫治疗方法
Approches of Cancer Immunotherapy
inhibited rates(%)
EAAL
x
16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4 16.6±0.4
DDP+EAAL
88.1±0.64* 88.9±0.16* 96.7±1.99* 55.8±0.33* 73.6±0.67* 66.2±0.12* 53.2±0.14*
组别
注射渠道 注射剂量 注射液量
(细胞数/只)
(ml)
每组裸鼠数量 (个体号)
每组肿瘤 平均体积（mm3
）
每组肿瘤 平均重量（g
）
G1 阴性对照组 微静脉
0
0.3
10 (1M01 – 1M10)
1444.69
0.96
G2
低剂量组
微静脉
1.7 × 105
0.3
10 (2M11 – 2M20)
1236.45
Q
1.602 1.732 2.080 1.424 2.297 2.169 1.885
(注：联合作用组、单顺铂组和单淋巴细胞作用组抑制率进行单因素方差分析,P<0.01 *) 11
EAL细胞的肿瘤抗原特异性分析
Donor Cancer Antigen NY-ESO-1 MAGE-1 MAGE-3 MAGE-10 P53 HIV FLU
10
EAL联合化疗的体外杀伤效果
培养后的淋巴细胞与顺铂以不同序贯方式联合对PLA-801D细胞的抑制率
Group
淋巴细胞作用前10h顺铂 淋巴细胞作用前8h顺铂 淋巴细胞作用前4h顺铂 淋巴细胞作用同时顺铂 淋巴细胞作用后4h顺铂 淋巴细胞作用后8h顺铂 淋巴细胞作用后10h顺铂
DDP
46±1.7 41.7±3.0 35.8±1.3 27.1±2.4 18.5±1.3 16.7±2.2 14.0±0.9
0.17 1.12 6.59 0.39 0.25 0.64 0.45 0.28 0.62 0.52 0.25 0.48 0.63 5.27 8.37 0.59 0.24 0.41 1.06 4.44 4.19
A2-02
0.86 2.57 2.99 0.07 1.15 16.43 0.06 0.36 6.00 0.15 0.22 1.47 1.13 12.24 10.83 0.2 0.25 1.25 0.6 11.76 19.60
可进行多次、高频治疗，达到最好的治疗效果
7
EAAL技术的临床-实验室操作流程
外周血
20-100ml
Manufacturing process of
回输
Immunecell-LC
100ml/次，1-8次
扩增及活化
收集诱导的 杀伤细胞
16
培养及扩增14-35天
8
EAAL的作用机制研究
9
自体肿瘤细胞的体外杀伤效应（IFN-γ）
• EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体 淋巴细胞）的简称。其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离 获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得 以CD3细胞为主的，包含CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD3+CD56+ NKT细胞、NK细胞， 细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，这 些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。
6
EAAL技术特点
使用无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染
细胞扩增的高效性和高活性:扩增效率约为2001000倍 不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用
独特的细胞培养工艺，少量外周血即可满足多次细胞回输的要求
可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细
胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果。
BC(%) AC(%) Multiple BC(%) AC(%) Multiple BC(%) (%) Multiple BC(%) AC(%) Multiple BC(%) AC(%) Multiple BC(%) AC(%) Multiple
A2-01
※慢性病毒感染性疾病
乙肝、丙肝
艾滋病
※慢性寄生虫感染
※糖尿病
※多发性硬化症
※系统性红斑狼疮
5
扩增活化的自体淋巴细胞（EAAL）的定义
• 自体免疫细胞治疗技术 • CD3+ T淋巴细胞为主（95.91%±0.24% ），含少量NK细胞 • 体外扩增活化 • 肿瘤杀伤功能 • 改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强
肿瘤疫苗
过继细胞免疫治疗
4
细胞免疫治疗
Cellular Immunotherapy
• 包括肿瘤在内的多种慢性病的最重要的生物治疗方法之一 • 肿瘤的细胞免疫治疗：
– 非特异性 ※ LAK细胞 ※ CIK细胞 ※ EAAL细胞
– 特异性 ※ Provenge,树突状细胞 ※ 肿瘤特异性T细胞
- 其它慢性病的细胞免疫治疗：
0.82
G3
中剂量组
EAAL 扩增活化的自体淋巴细胞 治疗肿瘤技术简介
Introduction of EAAL Therapy
1
肿瘤免疫治疗的机制
Mechanisms of Cancer Immunotherapy
• 通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿 瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。
• 前提： –肿瘤细胞有别于正常细胞 • 肿瘤抗原 • 肿瘤特异性T细胞免疫应答 • 肿瘤特异性抗体免疫应答 • 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用