STR SSR 微卫星分析
STR
荧光标记的选择
6-FAM = Blue HEX=Green TAMRA=Yellow
LIZ=Orange
荧光PCR
上游引物的5’端作荧Байду номын сангаас标记
PCR反应体系（25μl）：
10×PCR缓冲液(含15 mmol/L MgCl2）、1UTaq酶、dNTP各 0.1mmol/L，引物各0.2μmol/L、 模板DNA量约为50ng。 PCR条件： 94 ℃预变性5 min；94℃30 s、合 适的退火温度40 s，72 ℃1 min， 30 个循环；72 ℃延伸5 min。
多重荧光PCR
多重荧光PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以
上的特异引物对，同时扩增多个序列，从而产生高度特异 性的反应过程，该技术能够适应高通量DNA指纹分析的需 要，节省DNA模板和试验耗材，简化操作步骤，加速试验 进程 。
应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，
极大的提高效率。
微卫星DNA特点
数据大、分布广且均匀 具有极高的个体特异性 多态信息含量高 共显性遗传
微卫星标记的应用
品种鉴定
系谱分析
法医罪犯身份识别及亲子鉴定
群体间遗传距离分析 进化和遗传多样性研究等。
微卫星DNA分子标记技术
通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在 核苷酸排布及其外在形状表现规律的技术。
间、循环数、模板浓度）
毛细管电泳检测
微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后经遗传分析仪毛细管
电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不 稳定性。
微卫星名词解释
微卫星名词解释
微卫星名词解释如下：
微卫星亦称为简单重复序列或短串联重复序列，是多型性的一种类型。
指两个或多个核苷酸重复排列，且不同的重复序列相邻的形式，长度约2到10个碱基对，常见于非编码的内含子中。
由于重复单位及重复次数不同，使其在不同种族，不同人群之间的分布具有很大差异性，构成了STR遗传多态性。
不同个体之间在一个同源STR位点的重复次数不同。
通过识别基因组在特定位点的特定序列重复，可能创建一个个人基因档案。
目前已经有超过10000个STR位点被公开。
STR分析法已经成为法医学领域个体识别和亲权鉴定的重要分析方法，可应用于司法案件调查，也就是遗传指纹分析。
SSR分析技术的原理及案例介绍
SSR分析技术的原理及案例介绍微卫星标记（microsatellite），又称为短串联重复序列(short tandem repeats，STR)或简单重复序列（simple sequence repeats，SSR），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2~6个核苷酸的串联重复片段构成。
由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。
微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析，并根据大小分离等位基因进行检测。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP（限制性内切酶片段长度多态性）高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
技术特点（1）数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；（2）具有多等位基因的特性，提供的信息量高；（3）以孟德尔方式遗传，呈共显性（如果双亲的性状同时在F1个体上表现出来，即一对等位基因的两个成员在杂合体中都表达的遗传现象称为共显性），可鉴定出纯合子和杂合子；（4）实验重复性好，结果可靠。
每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
应用范围（1）遗传杂交育种（2）绘制染色体遗传图谱（3）DNA指纹和品种鉴定（4）种质资源保存和利用（5）基因组关联分析经典案例案例一题目：SSR linkage map construction and QTL identification for plant height and ear height in Maize（玉米SSR连锁图谱构建与株高及穗位高QTL定位）主要技术：SSR分型技术流程：文章摘要：用玉米自交系组合R15×掖478的F2群体构建连锁图谱，并通过1年2点随机区组试验设计，考察玉米229个F2：4家系成株期的株高和穗位高。
微卫星分析讲解
3核苷酸重复有10种类型。
每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成， 其核心序列呈串联重复排列，侧翼 序列位于核心序 列的两端，为保守的特异单拷贝序列。
PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，如放 射性同位素、银染、荧光标记。
我们使用的 T1 载体是 3000bb，太长的片段不易连接。
6、接头连接里面的接头是商业化接头还是贵公司设计合成的，依据是 是我们自己制备的。同问题 3，根据内切酶所切还是互补序列 一样。
沸煮
8、 解链 15lPCR 产物。 98℃沸煮 5-10min， 迅速冰浴 1 min， 48℃水浴 1-5min，迅速冰浴 1 min。这个步骤是否有问题，每步的目的是？
已知序列：先用SSR hunter扫描SSR位点， 再根据得到的序列设计引物进行后列设计引物 进行后续实验。
实验报告主要内容
文字性实验报告：包含实验试剂耗材、步骤、实验条件、 体系、引物序列、统计结果等；
各位点筛选多态性的PDF图；
2、引物设计合成及筛选
荧光引物标记：选取一对引物中的一条，合成寡核苷 酸链后在5’端合成上荧光素，FAM、HEX、TMR、ROX 标准组合；
设计与合成：荧光引物的标记效率和纯度对后期试验 至关重要，我们按照法医身份鉴定试剂盒和基因诊断 领域的标准来制备荧光引物；
筛选：我们利用M13（荧光/通用引物，18bp，在5’端 添加荧光标记，将M13互补序列添加到一条普通引物 的5’ ）加尾法提供筛选服务
测序原始数据（序列和峰图均去掉载体序列）；
PDF图及对应的excel表（微卫星分析）；
微卫星DNA标记
1微卫星DNA标记的发现1974年，Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微卫星DNA的重复序列。
此后，在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。
直到1986年，Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析，这时才得到重视。
1988年，Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。
1989年，Litt等[1]扩增到了人类基因组微卫星序列，从而创造了“微卫星（microsatellite）”这个名称。
2微卫星DNA的结构微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencere-peats，SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，是指以少数几个核苷酸（一般是1~6个）为单位串联重复的DNA序列。
这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中。
普遍认为，在染色体上，除着丝粒及端粒区域外，其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。
Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同，将其分为完全（无间隔）、不完全（有非重复单位的碱基间隔）和复合型（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）微卫星3种类型。
3微卫星DNA标记的优缺点3.1优点①分布广泛。
微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。
②多态性丰富。
由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大，因而造成其长度具有高度的多态性，使其可以包含大量丰富的信息。
③简易高效安全性。
微卫星检测方法简便且效率高，单个位点检测时间很短，一般不超过24h，并可以多个位点同时进行检测。
微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。
④保守与通用性。
微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。
⑤共显性遗传。
微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传，因而易区分纯合型和杂合型。
3.2缺点①建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都是非常繁琐、耗时的工作。
微卫星分析讲解
我们使用的 T1 载体是 3000bb，太长的片段不易连接。
6、接头连接里面的接头是商业化接头还是贵公司设计合成的，依据是 是我们自己制备的。同问题 3，根据内切酶所切还是互补序列 一样。
沸煮
8、 解链 15lPCR 产物。 98℃沸煮 5-10min， 迅速冰浴 1 min， 48℃水浴 1-5min，迅速冰浴 1 min。这个步骤是否有问题，每步的目的是？
目的是让 DNA 完全变性成单链 DNA，利于杂交。
1-5min， 98℃
9、杂交体系中的探针是根据 DNA 吗 不是，还有非目的 DNA。
11、菌落用的是何种菌 大肠杆菌的 TOP10 菌株。
12、TP -M13-SSR 程序中为何有两个不同的循环，目的是 前 35 个循环让引物结合扩增目的片段，后 10 个循环与 TP -M13 结合。
1、在接头连接反应中，核酸内切酶：Sau3AI,
5’
TGTAAAACGACGGCCAGT-FAM/HEX
微卫星扩增引物的来源：
直接应用已发表的微卫星DNA引物
使用近缘物种的引物
通过筛选DNA序列数据库，或筛选克隆的简 单重复序列，借助计算机软件进行引物—最好最根本的方法（引物开发）
2、目前样品是否有剩余，大概剩余多少，都哪些样品有剩余 叶片和 DNA 均有剩余，可以给您返样。
3、选用 Sau3AI 酶是否有依据 Sau3AI 能切出 4 碱基粘性末端，我们使用的接头序列是与该粘性末端匹配的，
识别 4 碱基的内切酶位点比 5 或 6 碱基的位点要多（依据概率计算） ，可以把基因组打断， 但又不会打得很碎。 也可以使用其他 4 碱基内切酶替换， 但接头序列也要与之改变。 文献中 常用的内切酶有 Sau3AI、EcoRI、Rsa I 等。
微卫星检测方法
微卫星DNA简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。
其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
1 微卫星DNA的构成及特点微卫星又称简单序列重复(Simple Se-quence Repeats，SSR)。
一般以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。
这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。
它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)，真核生物平均每50-150 kb就存在一个微卫星位点，如在人类基因组中每6 kb就有1个微卫星，禽类基因组中约89 kb出现1个微卫星。
微卫星DNA 数目巨大，人类基因组中约有5×104-1×105个(CA)n重复序列，重复次数一般为15-60次，重复单位相同，其长度一般小于200 bp，但也有的更长。
每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。
微卫星DNA
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二、微卫星的应用
• 1、STR应用于制作人类基因组遗传图谱 • STR在基因组内分布广泛、多态性程度高、可
自动化检测、成为制作基因组遗传图谱的首选 遗传标记。 • 1996年,法国Gene-thon实验室与美国国家卫生 研究院几个中心合作,建立了以6 000多个STR 为主体遗传标记、分辨率达194 kb的高精密度 图谱。 • STR的出现使遗传图的精度得到进一步提高,同 时也成为物理图上的标记,从而促进了遗传图 与物理图的融合。
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• 2 STR用于个体识别和亲权鉴定
• 因为STR广泛存在于基因组中,具有高度多 态性、杂合性和稳定性。当把几个STR位点 联合分析后,可以得到相当高的累积个体识 别率和父权排除率。
• 对粤、桂、琼地区14个人群STR基因座频率 调查显示15个STR基因座在14个人群中累积 个体识别能力在1. 05*10-16~3 .18*10-18, 累积非父排除率均在0.9999以上。
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• ⑶具有遗传连锁不平衡现象。
• ⑷可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则位 于非转译区的5′端和3′端不编码蛋白质。
• ⑸属于不稳定的DNA序列，其数目在某些遗传 病中有扩大现象，而这种扩增并非是减数分裂 的重组造成，扩大可发生在减数分裂过程中， 由一代传递给另一代，也可发生在有丝分裂中， 导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比较，微卫 星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定。
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• 目前,根据m DtNA、STR标记、Y染色体DNA 以及多态性A lu I序列的研究,大多数分子 遗传学家支持现代人类单起源学说,认为现 代人类起源于20万年前的非洲原始部落,然 后向世界各地迁徙。但也有学者支持现代 人类多起源,认为除非洲外,亚洲、欧洲也
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STR/SSR/微卫星分析
背景介绍
微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列。
微卫星位点通常通过PCR扩增和电泳检测，并根据片段大小分离等位基因进行分析；扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，传统方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影或银染的方法，费时费力效率低。
阅微基因基于5年的经验，利用ABI遗传分析仪对荧光标记的DNA片段进行检测，结合分子量内标进行DNA片段长度计算，使STR分型变得高效快捷，结果也更加精确。
服务项目
１．SSR引物开发
通过富集微卫星序列，开发出20-30条具有一定重复特征的微卫星序列，并且对序列进行多态性和特异性验证。
２. 引物筛选
选取部分代表性样本，利用普通引物进行PCR扩增，然后利用高分辨率芯片电泳或PAGE验证引物的特异性、扩增效率和基因座多态性等信息（图1）。
图1. 用岛津MultiNA芯片电泳仪进行引物筛选的结果
３．样本批量扩增
用带有荧光标记（FAM／HEX／TMR／ROX等）的引物，对批量样本进行PCR扩增。
我公司拥有高通量PCR仪平台，可以满足大量样本扩增需求。
４．测序仪检测
带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合，用3730xl等测序仪进行毛细管电泳，并得到原始数据（fsa文件，见图2）。
图2.应用3730xl测序仪检测得到的原始图谱
５．原始数据分析
编制panel和bin等文件，使用正版GeneMapper v4.0软件分析测序仪得到
的fsa文件，并生成PDF图谱和Excel文档（包括size、基因分型等信息），分析后的电泳图谱见图3。
图3.GeneMapper软件分析后的电泳图谱
６．群体遗传学分析
利用生物信息学软件（POPGENE、MEGA、PHYLIP、ARLEQUIN等）对上述数据进行进一步分析，绘制遗传连锁图谱、分析连锁不平衡和分析多态性等。
送样要求
细胞（≥106）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、基因组DNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）；引物信息、片段长度范围、琼脂糖电泳图等。
提供结果
引物、微卫星分析的原始数据以及GeneMapper生成的PDF图谱、包含片段长度等信息的Excel文档和进一步的分析结果等。
成功案例
到目前为止，我公司与上百家科研机构建立合作，进行过多个物种的引物开发、多态性分析、种系鉴定和连锁图谱构建等工作，包括人、小鼠、大鼠、兔、马、犬、牛、大熊猫、鱼、虾、麻雀、蜜蜂、蚊子、蚜虫、瓢虫、小麦、玉米、大豆、棉花、杨树、苹果、葡萄和真菌等。
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