荧光光谱基础知识
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱基础知识
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy )韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。
除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。
在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。
但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。
分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。
Ee 大约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级，可见⊿Ee>⊿Ev>⊿Er分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。
从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭（quenching）。
如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。
磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。
所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱原理荧光光谱是一种常见的分析方法，常用于化学、生物学、药学等领域。
下面，我们将详细介绍荧光光谱的原理及其应用。
一、荧光现象的基本原理荧光现象是指某些物质受到激发后，能够发出比激发光波长长的荧光。
这种现象的实现需要三个条件：激发光源，荧光物质及荧光检测系统。
其中，荧光物质是关键，只有某些物质具有这种特性。
二、荧光光谱图的基本构成荧光光谱图是用荧光物质受到特定波长的激发后，发出荧光的辐射能量与波长之间关系的曲线图。
其基本构成有以下四个参数：激发波长，发射波长，发射强度及荧光寿命。
激发波长：又称刺激波长，是激发荧光物质时所使用的波长。
发射波长：是荧光物质在受到激发后所发出的荧光辐射波长。
发射强度：是荧光物质发射的荧光辐射强度。
荧光寿命：是荧光物质在激发后发射荧光的时间长度。
三、荧光光谱的应用1. 化学分析：荧光光谱可以用于药物、生化试剂的分析，还可以用来探测污染物质和有毒化合物。
如气相色谱-荧光检测法(GC-FLD)检测环境中苯骈克星的浓度。
2. 生物医学：荧光光谱可以用于细胞成像、蛋白质分析、DNA测序、荧光定量PCR等领域。
如荧光定量多聚酶链式反应(qPCR)检测病毒RNA的表达水平。
3. 材料检测：荧光光谱可以用于材料表面缺陷的检测、矿物物质含量的分析等，如纳米粒子的荧光检测。
四、荧光光谱技术的优越性与传统的分析技术相比，荧光光谱技术具有很多优势，如高灵敏度、快速、准确性高、无需预处理、不易受样品污染等。
综上所述，荧光光谱技术在许多领域都有着广泛的应用前景。
相信在未来的发展中，荧光光谱技术将会更加成熟和完善，驱动着科技的进步和实践的发展。
荧光光谱基础知识
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy )韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。
除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。
在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。
但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。
分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。
Ee 大约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级，可见⊿Ee>⊿Ev>⊿Er分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。
从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭（quenching）。
如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。
磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。
所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。
第四章荧光光谱
第一节
概 述
分子发光包括荧光（fluorescence）、磷 光（phosphorescence）、化学发光 （chemiluminescence）和散射光谱 （scattering spectrum）等。 利用某些物质被紫外光照射后所产生的、 能够反映出该物质特性的荧光，以进行 该物质的定性分析和定量分析称为荧光 分析。
（2）共轭效应
含有低能量的π→π*跃迁能级的芳香 官能团化合物的荧光最强，而且也是最 有用的。任何有利于提高π电子共轭程度 的结构改变。都将提高荧光效率，并使 荧光波长向长波方向移动。 例如，在多烯结构中， ph(CH=CH)2ph和ph(CH=CH)3ph在苯中荧 光效率分别为0.28和0.68。
（3）刚性结构
多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈 的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小。 也就减少了碰撞去活的可能性。同时，刚性平 面结构的分子减小内转换的速率，从而增加量 子效率。 例如，在相同条件测得，芴和联苯的荧光效 率分别为1.0和0.2。
化学环境对荧光（或磷光）的影响
8—巯基喹啉的荧光峰的位置和荧光效率与 溶剂介电常数的关系
溶剂种类 四氯化碳 氯仿 丙酮 乙腈 介电常数 2.24 5.2 21.5 38.8 荧光峰波长/nm 390 398 405 410 荧光效率 0.002 0.041 0.055 0.064
温度对荧光强度的影响
1.2 激发光谱和发射光谱
（1）激发光谱--选择荧光（磷光）的最大发射波 长为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光 强度的变化。 （2）发射光谱 简称荧（磷）光光谱。将激发光 的波长固定在荧（磷）光最大发射波长处，测 定不同发射波长处的荧（磷）光强度，即得到 荧（磷）光发射光谱。
荧光光谱
荧光光谱
荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。
当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。
激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。
灵敏度高：荧光分析的最大特点是灵敏度高，通常情况下要比分光光度计的灵敏度高出2-3个数量级。
选择性强：包括激发光谱和发射光谱，在鉴定物质时，通过选择波长可以使分子荧光分析有多种选择。
试样量少和方法简便。
技术参数：
1.功率50W，最大电压50KV，最大电流2mA
2.50W端窗Pd靶X光管
3.硅漂移计数器，分辨率小于170eV
4.3位置次级靶自动转换系统，即3束X激发光源。
5.可选真空、充气、常压系统
主要特点：
1.偏振X光激发样品，具有极低的背景，极佳的灵敏度
2.真正意义的Na-U的全分析，无需滤光片。
3.分析的含量范围ppm级到100%
4.极为丰富的软件系统，提供各种方法及校正模式。
第五章荧光光谱法
荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。
荧光分析法也有它的不足之处。主要是指它比起其它方法来说应用范围 还不够广泛。因为有许多物质本身不会产生荧光。
第一节 荧光光谱的基本原理
荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激 发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因
c.自吸收（Self-absorption）发生在荧光发射波长同化合物的
吸收峰重迭的情况下，当荧光通过溶液时便被吸收一部分。
第三节 荧光的测量
一、荧光分光光度计
激发光源—— 作用：提供连续辐射，激发样品 要求：光源（I0）强度足够；强度与波长无关 种类： 汞弧灯、氢灯或氙灯。
激发单色器---作用：用于选择激发光的波长
在光度法中，ε表示方法的灵敏度。ε↑， 其测定灵敏度↑。 在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的ε及 发射时的量子效率ф有关。荧光法绝对灵敏 度理论定义为фε的乘积（ε单位μg·cm-2） ,фε ↑，荧光强度↑，测定灵敏度↑。荧 光法绝对灵敏度实际定义为фε/H （H发射 光谱半峰宽度μm-1 ） 。
三、发光强度同浓度的关系
荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产
率 。If = Ia
据Beer定律：Ia = I0 - It = I0(1- e - l C)
代入上式得：If = I0(1- 10 - l c)
= I0(1- e -2.3 l c)
整理得：
If =2.3 I0 lc
I 在一定条件下： f = K c
由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能 级时，则以光的形式发出，所产生的光即是荧光．
荧光光谱和吸收光谱的“镜象对称”关系
荧光光谱法基本原理
荧光光谱法基本原理
荧光光谱法基本原理是利用物质在受到光激发后，从基态跃迁到激发态，并在相应的跃迁过程中发射荧光光子。
荧光光谱法使用荧光现象进行分析研究，具有高灵敏度、高选择性、无破坏性等优点。
在荧光光谱法中，首先将样品暴露于特定波长的激发光源下，使样品中的分子吸收光子并处于激发态。
然后，激发态分子通过非辐射过程返回基态，并在返回的过程中发射荧光光子。
这些发射的荧光光子具有特定的波长和强度，可以通过光谱仪进行检测和记录。
荧光光谱法的原理基于分子能级的存在。
当分子处于基态时，电子位于较低的能级上，称为基态能级。
当分子受到激发光的照射时，电子会吸收能量并跃迁到较高的能级，称为激发态能级。
在激发态能级上，分子处于不稳定的状态，会通过非辐射过程返回基态。
在非辐射过程中，激发态分子可以通过热振动或能量转移与周围分子相互作用，将能量传递给周围分子而不发生辐射。
这个过程被称为内转换。
此外，在内转换的同时，激发态分子也可能通过辐射过程将能量以光子的形式发射出来。
这个过程被称为外转换，也就是荧光发射。
荧光光谱检测时，通常会记录样品在一定波长范围内的荧光发射强度。
通过观察发射光子的波长和强度，可以得到关于样品的信息，如含量、结构、环境等。
此外，荧光光谱法还可以与
其他技术结合，如色谱、电泳等，实现多种分析应用。
总的来说，荧光光谱法基于物质在受到激发后发射荧光的原理，利用荧光光子的波长和强度来获得样品的信息。
这种方法在生物科学、化学分析、环境监测等领域有着广泛的应用。
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C H3 C O
n π∗ ; R带
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π
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(一) 分子吸收光谱 2. 分子吸收光谱 若用一连续的电磁辐射照射样品分子， 若用一连续的电磁辐射照射样品分子， 将照射前后的光强度变化转变为电信号并 记录下来，就可得到光强度变化对波长的 记录下来，就可得到光强度变化对波长的 关系曲线，即为分子吸收光谱 分子吸收光谱。 关系曲线，即为分子吸收光谱。
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-3
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分光光度法的特点
仪器设备简单 操作简便、快速， 设备简单， (3) 仪器设备简单，操作简便、快速，选 择性好。 择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发 提高了选择性， 现，提高了选择性，一般不需分离干扰物 质就能进行测定。 质就能进行测定。 应用广泛。 (4) 应用广泛。几乎所有的无机离子和具 有共轭双键的有机化合物都可以直接或间 接地用吸光光度法进行测定。 接地用吸光光度法进行测定。
仪器分析——第十二章 仪器分析——第十二章
ultravioletultraviolet-visible spectrophotometry
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分光光度法的特点
测定的灵敏度高 灵敏度高。 (1) 测定的灵敏度高。常用于测量质量分数 为 10 ％ ~ 1％的微量组分，甚至可测定质 的微量组分， 量分数低至 10 ％ ~ 10 ％的痕量组分。 的痕量组分。 测定的准确度高。 准确度高 (2) 测定的准确度高。一般吸光光度法测定 ％，若使用精密仪器 的相对误差为2％ ~ 5％，若使用精密仪器, ％，完全可以满足 相对误差可降至1％ ~ 2％，完全可以满足 微量组分测定的要求。 微量组分测定的要求。
I0 log = Klc I
定律的数学表达式。 Lambert－Beer定律的数学表达式。
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二、Lambert－Beer定律 Lambert－Beer定律
式中： 式中：
I0 log = Klc I
I 称为透光率 透光率， 称为透光率，用符号T表示 I0
I log 称为吸光度 吸光度， 称为吸光度，用符号A表示 I0
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语
KMnO4 的吸收曲线
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱 (Absorption spectra of Cr2O72-、MnO4- ) 525 545 1.0 0.8 Absorbance 0.6 0.4 0.2 350
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语 3. 蓝移和红移
由于取代基的作用或溶剂效应， 由于取代基的作用或溶剂效应，导致发色 团的吸收峰向长波方向移动的现象称为向红移 团的吸收峰向长波方向移动的现象称为向红移 向长波方向移动 简称红移 发色团的吸收峰向短波方向移 红移。 动，简称红移。发色团的吸收峰向短波方向移 动的现象称为向紫移动，简称蓝移。 的现象称为向紫移动，简称蓝移。 蓝移
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350
Cr2O7
2-
MnO4-
400
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500
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600
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700
λ/nm
紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语 吸收曲线可以提供物质的结构信息， ③ 吸收曲线可以提供物质的结构信息，并 作为物质定性分析的依据之一。 作为物质定性分析的依据之一。 ④不同浓度的同一种物质，在某一定波长 不同浓度的同一种物质， 有差异， 处吸光度A 下吸光度 A 有差异，在λmax处吸光度 的 差异最大。 差异最大。此特性可作作为物质定量分析 的依据。 的依据。
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(一) 分子吸收光谱 (1) 电子能级跃迁 所需的能量较大， 所需的能量较大，其能
产生的吸收光谱主要处于紫 量在1～20eV，产生的吸收光谱主要处于紫 外－可见光区(200～780nm) ； (2) 振动能级跃迁 振动能级的能量差约为
0.025～1eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外 区，红外光谱或分子振转光谱； 红外光谱或分子振转光谱； 或分子振转光谱
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(四 ) 吸 收 带
3. B带 从德文Benzenoid(苯的)得名
为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸 收带。 跃迁和苯环的振动重叠引 收带。这是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引 起的。 起的。苯蒸气在230～270nm处出现精细结构的 吸收光谱， 吸收光谱，称为笨的多重吸收带或精细结构吸收 在极性溶剂中或苯环上有取代基时， 带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的 吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰， B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中 心在256nm，ε＝220。
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语
有一些含有 电子的基团(如 有一些含有n电子的基团 如—OH、—OR、 含有 电子的基团 、 、 —NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色 、 等， 功能(不能吸收λ>200nm的光 的光)， 功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与发色 不能吸收 团相连时，就会发生 共轭作用， 团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色 共轭作用 团的生色能力(吸收波长向长波方向移动， 团的生色能力 吸收波长向长波方向移动，且吸 吸收波长向长波方向移动 收强度增加)，这样的基团称为助色团。 收强度增加 ，这样的基团称为助色团。
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hc ∆E = E 2－E 1 = hν = λ 返回
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E = Ev + Er + Ee
(一) 分子吸收光谱
电子能级间跃迁 的同时， 的同时，总伴随 有振动和转动能 级间的跃迁。即 级间的跃迁。 电子光谱中总包 含有振动能级和 转动能级间跃迁 产生的若干谱线 而呈现宽谱带。 而呈现宽谱带。
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(一) 分子吸收光谱 (3) 转动能级跃迁 振动能级的能量差约为
0.025～0.003eV，跃迁产生的吸收光谱位 于远红外区,远红外光谱或分子转动光谱； 远红外光谱或分子转动光谱； 或分子转动光谱 (4) 吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃 迁能级间的能量差所决定， 迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部 能级分布状况，是物质定性的依据； 能级分布状况，是物质定性的依据；
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语
2. 发色团和助色团
发色团也称为生色团。 发色团也称为生色团。分子中的某一基 团能在一定的波段范围内产生吸收而出现 吸收带，这一基团称为生色团。 吸收带，这一基团称为生色团。典型的生 色团有羰基、羧基、酯基、偶氮基、 色团有羰基、羧基、酯基、偶氮基、硝基 以及芳环等。这些生色团的结构特征是都 以及芳环等。这些生色团的结构特征是都 电子。 含有π电子。
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(四 ) 吸 收 带
4. E带 是由苯环结构
中三个乙烯的环状共 轭系统的跃迁所产生 的。分为E1和E2吸收 带，其中E1在185nm 附近， 附近，ε=47000，E2在 204nm，ε=7900，均 为强吸收。 为强吸收。
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(四 ) 吸 收 带
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语 同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 ① 同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 λmax 不同浓度的同一种物质， ② 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λ 不变。而对于不同物质， 形状相似 max不变。而对于不同物质，它 们的吸收曲线形状和λ 则不同。 们的吸收曲线形状和 max则不同。
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紫外－ (三) 紫外－可见吸收光谱的常用术语 4. 浓色效应和淡色效应
由于化合物的结构改 变或其它效应,使吸收强 度增加的效应称为浓色 度增加的效应称为浓色 的效应称为 效应； 效应；使吸收强度减弱 的效应称为淡色效应。 的效应称为淡色效应。 淡色效应
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紫外－ (二) 紫外－可见吸收光谱的产生 预 备 知 识
有机化合物的紫外—可见吸收光谱是三 有机化合物的紫外 可见吸收光谱是三 种电子跃迁的结果： 种电子跃迁的结果： σ电子、π电子、n电子 电子、 电子 电子、 电子 电子。 电子
σ
H
C H
π
O
n
＜π＜n＜ ＜* σ* σ π
π∗ ; K带
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二、Lambert－Beer定律 Lambert－Beer定律
朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年 和1852年研究了光的吸收与有色溶液液层的厚 度及溶液浓度的定量关系， 度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分 析法的理论基础。 析法的理论基础。