双水相萃取技术资料整理
双水相萃取技术Aqueous two phase extraction （ATPE）化学系应用化学徐** 10101570*** 【摘要】介绍了双水体系的概念、双水相萃取的种类、原理，影响分配的因素。
分析了双水相萃取的优势，双水相萃取的应用范围。
列举了食品、化学、化工三个领域的应用实例。
介绍了双水相技术与其他技术的结合。
最后针对双水相萃取技术的特点及局限性对其应用前景进行了展望。
1、基本概念1.1 双水体系双水体系指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶两项或者多项水相体系。
成中大部分为水，可用于亲水性生物活性物质的萃取分离。
1.2 双水相萃取的种类1.2.1双高聚物双水相体系两相都由溶解于水的高聚物组成，都具有高度的不互溶性，其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向。
两相常常可能具有相近的密度，表面张力也较小，正因为如此，双水相体系分层比传统的溶剂萃取要困难，可通过离心分离等办法分为二相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。
可形成双水相体系的聚合物有很多，典型的聚合物双水相体系有：聚乙二醇（polyethylene glycol，略作PEG)/葡聚糖（dextran），聚丙二醇（polypropylene glycol)/聚乙二醇和甲基纤维素（methylcellulose)/葡聚糖等。
1.2.2聚合物-盐双水相体系：双水相体系也可以由高浓度的盐溶液和高聚物溶液组成。
其成相机理是盐析的结果，如PEG与碱性磷酸盐或硫酸盐形成的两相。
一般，上相富含高聚物，下相富含无机盐。
该双水相体系容易分离，且价格便宜。
但是当盐浓度过高时，蛋白质会变性或从溶液中沉淀出来，所以此体系不太适用于蛋白质纯化。
此类双水相体系一般采用聚乙二醇（PEG）作为其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。
2、基本原理2.1 萃取原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
2.2分配定律分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。
物质在双水相体系中的分配系数K等于两相中生物物质的浓度比，由于蛋白质的K值不相同（大致在11~10之间），因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。
分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下其中C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。
2.3影响分配的主要参数影响分配的主要参数有聚合物的分子量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。
适当选择各参数即在最适条件下，可达到较高的分配系数和选择性。
2.3.1成相聚合物的相对分子质量高聚物的相对分子质量对分配的影响符合下列一般原则:对于给定的相系统，如果一种高聚物被低相对分子质量的同种高聚物所代替，被萃取的大分子物质，如蛋白质、核酸、细胞粒子等，将有利于在低相对分子质量高聚物一侧分配。
如PEG-Dextran系统中，PEG相对分子质量降低或Dextran相对分子质量增大，蛋白质分配系数将增大。
相反，如果PEG相对分子质量增大或Dextran相对分子质量降低，蛋白质分配系数则减小。
这一原则适用于不同类型的高聚物相系统，也适用于不同类型的被萃取物质。
2.3.2成相系统的总浓度当接近临界点时，生物大分子均匀地分配于两相，分配系数接近于1。
如成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1,或减小低于1。
增大时,系统远离临界点,系线长度增加,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相。
2.3.3盐类的影响由于各相应保持电中性，因而在两相间形成电位差，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大影响。
加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。
当盐类浓度很大时(1-~5 mol/L NaCl)，则由于盐析作用，蛋白质易分配于上相。
由于HPO42-离子在PEG-葡聚糖系统中的分配系数很小，因而加入pH大于7的磷酸盐缓冲液能很方便地改变相间电位差，而使带负电荷的蛋白质移向富聚乙二醇的相。
2.3.4 pH值pH会影响蛋白质中可以解离基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。
pH也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，也会使相间电位发生变化，而影响分配系数。
2.3.5 温度温度的影响是间接的。
大规模双水相萃取一般在室温下进行，不需冷却，因为（1）成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；（2）常温下溶液粘度较低，容易相分离；（3）常温操作节省冷却费用。
2.3.6荷电PEG作为成相聚合物在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差相间电位差与电荷数成反比，利用带电PEG能产生较大的相间电位，故能使分配系数增加。
3、双水相萃取的优势ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质（蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等）、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：（1）含水量高（70%--90%），在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用。
（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；（3）分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；（4）界面张力小（10-7～ 10-4mN/m），有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；（5）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；（6）大量杂质可与固体物质一同除去；（7）易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；（8）操作条件温和，生物相容性高。
整个操作过程在常温常压下进行；（9）亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。
4、应用范围4.1酶的提取与纯化双水相的应用始于酶的提取，但由于PEG/精葡聚糖体系太贵，而粗葡聚糖粘度太大。
目前研究和应用最多的是PEG/盐体系。
在这体系中酶在上相上，菌体分配在下相或界面上。
如果有合适的条件，不仅可以从发酵液中提取酶，实现与菌体的分离，而且还可以将各种酶彼此分离。
4.2生物活性物质的分析检测生物分子，常需要另一种与其定量复合的分子，只要复合物和反应物之一在双水相中具有不同的分配系数，并最好能分配在不同的相中，就能更好的进行分析。
双水相萃取技术已成功的应用于免疫分析，生物分子相互作用测定细胞数的测定。
4.3 DNA 纯化从样品中提取DNA 的技术对于现代生物技术尤为重要，但是样品中常常含有核酸酶，它会将目标DNA 在被提取之前便分解。
实验表明，在聚合物-盐双水相体系中，DNA 片段会分离在体系上层，通过某种配体，核酸酶会被分离到体系下层并失去活性。
因此聚合物-盐双水相体系在纯化DNA 同时保护DNA 不被核酸酶分解这一方面应用广泛。
4.4食品工业PEG/氯化钠体系在分离小分子（如多肽、核酸）方面十分有效。
这些化合物经常出现在食品添加剂中，所以该体系可以被食品工业应用，分离或者去除特定的香味、甜味等等5、应用实例5.1应用双水相萃取技术提取双孢蘑菇多糖利用PEG/ （NH 4） 2SO 4双水相体系萃取双孢菇多糖称取一定量的PEG 溶于10 mL 双孢菇多糖提取液中，再称取一定量的（NH 2） 2SO 4溶于10 mL 提取液中。
搅使其溶解，并将二者倒进同一个50 mL 离心管中。
充分摇匀，静置待其分相完全，离心5 min ，溶液形成两相，记下上下相的体积，再用移液管将两相分离。
两相各取1 mL到试管中，加水稀释。
再从稀释液中取1 mL 加0.5 mL 6 %苯酚和2.5 mL浓硫酸，充分摇匀，静置30min后用可见分光光度计在490 nm下侧吸光度值。
对照组是用蒸馏水代替双孢菇提取液。
5.2 双水相萃取法分离铍(Ⅱ)、铁(Ⅲ)与铁(Ⅱ)、铬(Ⅲ)、锰(Ⅱ)、铝(Ⅲ)铍(Ⅱ)在pH 3．5～7．o及铁(1I)在pH 4．o～7．0范围内可以被PEG相几乎完全萃取，而铝(Ⅲ)、铬(Ⅲ)在pH 1．O～7．0、锰(1I)在pH 1．o～4．5、铁(Ⅱ)在pH 1．o～4．5则不被萃取。
从而实现了将铍(Ⅱ)(pH 3．5)、铁(Ⅲ)(pH 5．0)与铝(Ⅲ)、铬(Ⅲ)、锰(Ⅱ)、铁(Ⅱ)混合离子的定量分离。
5.3 利用双水相乙醇-磷酸氢二钾体系萃取甘草有效成分基于与水互溶的普通有机溶剂的双水相萃取体系，根据分相后有机溶剂相的体积变化，选择乙醇(Et0H)一磷酸氢二钾(K2HPO4)体系萃取甘草有效成分。
确定萃取的最佳条件是：当双水相体系的总量为lOmL，y(EtOH)：r(H2O)=3：2，磷酸盐的质量为1.5 g，在上述条件下，EtOH—K2HPO4体系的两相分配完全，分配系数(K)最大为12．80，收率(r)高达98．3％。
6、双水相技术与其他技术的结合双水相萃取是基于液-液萃取技术同时考虑保持生物活性所开发的一种新型生物分离技术。
该技术具有分离时间短、易于连续操作、保持生物活性等优点。
为了提高该技术的专一性，加快萃取速率，解决易乳化的问题，双水相萃取技术与其他几种生物分离技术（亲和色谱、膜分离、吸附剂微粒吸附、电泳）的结合解决了以上问题，从而促进了双水相萃取技术的进一步发展。
6.1 双水相萃取技术与亲和色谱技术的结合亲和色谱是利用偶联亲和基团的色谱吸附介质为固定相，亲和吸附目标分子，使目标分子得到分离纯化的色谱方法。
亲和色谱具有分离过程简单、纯化倍数高、选择性强，在蛋白质的分离纯化领域占据重要地位。
为了提高双水相萃取的专一性，正是借鉴亲和色谱的以上优点，发展了一种亲和双水相分配技术。
该技术对成相聚合物进行修饰，即将亲和配基通过（如离子交换基团、疏水基团、染料配基、金属螯合物配基以及生物亲和配基等）通过化学交联或分配的方法结合到成相聚合物上，有选择的将某种蛋白萃入该相中，而杂蛋白仍旧留在另一相中。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取全解
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时，在一定浓度下，由于盐析作 用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外， 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
缺点：
• 成相聚合物的成本较高， 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大，不易定量控制。 • 易乳化，相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
双水相萃取技术汇总
(2)PEG的循环 在大规模ATPE过程中，成相材料 的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费 用，还可以节约化学试剂．降低成本。PEG的回 收有两种方法：①加入盐使目标蛋白质转入富盐 相来回收PEG；②将PEG相通过离子交换树脂， 用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。
研究表明，在相体系固定时，预分离物质在相当 大的浓度范围内，分配系数K为常数，与溶质的 浓度无关，只取决于被分离物质本身的性质和特 定的双水相体系的性质。根据2 相平衡时化学位 相等的原则，从Brownstedt 方程式求得分配系数 K： ln K E M
kT kT
M- 物质分子量术的特点
(1)双水相体系中的传质和平衡速度快，回收率高， 分相时间短，自然分相时间一般为5-15 min，相 对某些分离过程，可以实现快速分离，且能耗较 低。
(2)两相间的界面张力小， 一般为1×10-7-----1×10-4mN.m-1，比一般的有机萃取两相体系界面 张力低得多，因此两相易分散，有利于强化相际 间的物质传递，整个操作过程可以在常温常压下 进行，不会引起生物活性物质失活或变性。
k- 波尔兹曼常数
T- 温度
在实际单元操作中，由于无法固定整个双 水相体系，也很难确切地知道被分离的原 液含有多少其他物质，这些因素共同作用 和影响，使整个体系变得相当复杂，因而 目前尚没有定量的关联模型能预测整个体 系的分配关系。最佳的操作条件须依靠实 验得到。
双水相形成条件和定量关系常用相图来表示，用 三角形相图或直角坐标相图表示。图1 是典型的 高聚物- 高聚物- 水双水相体系的直角坐标相图， 2种聚合物A、B 以适当比例溶于水就会分别形成 有不同组成、密度的2 相，轻相组成用T 点表示， 重相组成用B 点表示，由图可知上下相所含高聚 物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。C 点 为临界点或褶点。曲线TCB 称为结线，直线TMB 称为系线。结线上方是2 相区，下方为单相区。 所以组成在系线上的点，分为2 相后，其上下相 组成分别为T 和B，T、B 量的多少服从相图的杠 杆定律。即T 和B 相质量之比等于系线上MB 与 MT的线段长度之比。又由于2 相密度相差很小， 故上下相体积之比也近似等于系线上MB 与MT 线段长度之比。
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
第八章 双水相萃取技术
（一）双水相中聚合物组成
1\当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与 无机盐以不同的浓度混合时，可能存在三种情况：
• a、完全混溶性(匀相溶液)； • b、物理的不相溶性(相分离)； • c、复杂的凝聚(相分离，聚合物聚集在同一相中，
纯溶剂-水聚集在另一相中) • 2\当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷
数和萃取专一性 • （八）易于工艺的连续化生产
8
第二节 双水相分配原理及其理论基础
• 一、双水相系统分配原理 • 是否会形成双水相，取决于混合熵增和分子间作
用力两个因素。 • 混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力则
随分子量的变大而增强。 • 当两种高分子聚合物之间互不相溶时，由于相对
分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过 程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的 周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平 衡时，即形成富含两种不同聚合物的两相。
• 成相物质的总浓度越高，系线越长，生物 分子越容易分配于其中的某一相.
23
其它因素
• 1.分配物质的分子量 • 2.盐的种类和浓度 • 3.pH值影响 • 4.温度的影响 • 5.通气和搅拌的影响
M×10-4
24
第三节 双水相萃取操作及设备
• 一、 双水相系统的选择:易于两相的分离. • • 根据待分离蛋白质和共存杂质的表面疏水
• 曲线把均相区和两相区域 分隔开，称为双结点线。 下区为均相区，上区为两相 区。
• 连接双结点线上两点的直 线叫系线。
• 临界点：当系线长度趋向 于零时，即在图中的K点， 两相差别消失，任何溶质 在两相中的分配系数均为1， 成为单相体系。
PEG
VT BM
VB MT
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1双水相萃取的原理及特点3.1.1双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：（1）含水量高（70%〜90%），是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；（2）分相时间短，自然分相时间一般为5~15min ；⑶界面张力小（10-7〜10-4mN/m），有助于强化相际间的质量传递；⑷不存在有机溶剂残留问题；（5）大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；（6）易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2双水相萃取在分离和提取各种蛋白质（酶）上的应用用聚乙二醇（PEG）/羟丙基淀粉酶（Reppal PEG）体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000（12%）-ReppalPES（40%），PGK在上相、GAPGH 在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/（NH4）2SO4 双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取a淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000（15%）-（NH4）2S04（20%），pH=8，a淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取.-27页文档资料
双水相萃取法是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。 双水相系统可将水溶性的酶、 蛋白质等生物活性物质从一个 水相转移到另一水相中。
2.2％的葡聚糖水溶 液与等体积的0.72％ 甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后， 可得到两个粘稠的液 层，下层含有大部分 葡聚糖．上层含有大 部分甲基纤维素纳， 两相中 98％以上的 成分是水。
双水相系统也可由聚合物和无机盐之间。只要浓度达到一 定值，也 会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理 尚不清楚，一 种解释为“盐析”作用。
不相溶性是一普遍现象，其溶剂也不一定是水，也可 能是有机溶剂。
如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体 系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二 醇相混时，可形成四相体系。
一、双水相的形成
高聚物水溶液的混合
互不溶性，形成两个水 相，两种聚合物分别富 集于上下两相；
复合凝聚，也形成两个 水相，但两种高聚物主 要集中于一相。另一项 几乎为水；
完全互溶形成均相的高 聚物水溶液。
一、双水相的形成
双水相形成机理
双水相系统的形成在于聚合物的不相溶性产生的空间障碍 作用。
两个亲水成分的非互溶性，通常来源于各自分子结构上的 不同所产生的相互排斥作用。相反两种高聚物如果产生引 力则会形成互溶或者复合凝聚。
(1)聚合物的影响
(2)体系中无机盐离子的影响
在PEG/DEX体系中，无机盐离子在两相中也有不同 的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中 性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产 生很大的影响。
pH=6.9 溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电。
KCl KNa
此性质常被用于提高 物质在双水相系统的 分配系数。
双水相萃取
当萃取体系的性质不同，物质进入双水相体
系后，目标物质在上、下相中的浓度不同， 从而在上相和下相间进行选择性分配，与常 规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小 的分配系数。
1.3 双水相萃取技术的基本原理
1.3.2 双水相萃取的原理
• 分配规律服从Nernst分配定律，即K=ct/cb。
• 在相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度
• 蛋白质、生物酶、菌体、细胞、细胞器
• 亲水性生物大分子
• 氨基酸、抗生素等生物小分子物质的
Hale Waihona Puke 3双水相萃取技术的应用
蛋白质（酶）的分离和提取 抗生素的提取和纯化 天然食用色素的萃取 中草药的有效成分的提取
贵金属的分离与检测
3.1 蛋白质（酶）的分离和提取
• 对发酵液、细胞培养液、植物、动物组
织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取 • 绝大多数是用 PEG 作上相成相聚合物， 葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一 种作下相成相物质
工艺复杂等 • 双水相体系优点:对贵金属以及稀有金属
的分离与检测环境友好、废弃物少、对
人体无害、运行成本低、工艺简单
3.5 贵金属的分离与检测
实例： • 利用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取分
离 废 弃 印 刷 线 路 板 处 理 液 中 的 金。
• 最佳条件：实验在温度为25℃，pH为 1.0，PEG2000的质量分数为15%， ( N H 4) 2S O 4的 质 量 分 数 为 2 0 % 。
范围内，分配系数K为常数，与溶质的浓度无关， 只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水 相体系的性质。
1.3 双水相萃取技术的基本原理
1.3.2 双水相萃取的原理
A-B-水双水相体系 图