双水相萃取技术

双水相萃取技术( two-aqueous phase extractio)n一、前言近年来，随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。

与上游过程相比，目前作为下游过程的生化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了生物技术的工业化发展。

因此，就迫切需要一种分离步骤少，收得率高，处理时间短，并且易于放大的生化分离纯化技术，双水相萃取技术就满足了这一需要。

特别是基因工程技术的发展，需要从细胞中提取高质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在大量的轻质细胞碎片，给遗传物质的提取形成了很大的干扰，通常通过离心分离和溶剂萃取难以得到高纯度高活性的遗传物质，而通过双水相初步提取，可以使目标物和轻质碎片得到很好的分离，且目标物的活性几乎没有损失。

因此双水相萃取技术得到了很大的重视，并且在近20 年里取得了较大的发展。

二、发展史双水相萃取技术又称之为水溶液两相分配技术( Partition of two aqueous phase system)1、1896 年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”(in compatibility ) ---------- 体系的发现2、1956年瑞典伦得(Luhd)大学的Albertson发现双水相萃取技术可用于蛋白质的选择分离，但目标蛋白同成相高聚物的分离是影响了其大规模工业应用。

------------------------ 发现可以用于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，从而大大改善了胞内酶的提取过程，提高了酶的收得率。

---------------------------- 利用于活性物质的提取4、1989年，Diamond等人以Flory —Huggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。

开始理论研究5、20 世纪90 年代以来，由于控制和优化技术的发展，将生化分离过程进行集成化(process integratior)和将生化反应与分离过程集成化成为了研究热点。

―――――――――― 集成化研究三、与传统分离方法的比较在生物发酵产品制备中，细胞和细胞碎片的除去是整个分离纯化的第一步，也是最为关键的一步，它将直接影响到后续工序的收得率。

传统的分离方法主要采用离心法及过滤法。

这两种方法在实际应用中都有一定缺点，如离心法能耗高，过滤法膜孔容易堵塞。

而双水相萃取，整个操作可以连续化，除去细胞和细胞碎片的同时，还可以起到纯化目标物的作用。

各种方法的比较见表A，可以看得出，在除去细胞碎片的各种方法中，双水相萃取技术是传统的离心分离和过滤法无法比拟的。

和传统的酶粗分离方法，如盐析，有机溶剂沉淀相比，双水相萃取分离技术也有很大的优势。

见表B，一般说来，传统的分离方法达到与双水相萃取相同的处理量时，需要比双水相萃取多3到10倍的设备，而且比双水相萃取分离方法放大困难。

虽然双水相萃取技术具有很大的优势，但目前真正工业化的例子却很少。

主要原因是大规模分离时，双水相萃取的成本较高，使得其技术上的优势大打折扣。

大规模分离中，双水相萃取总成本中主要是原料成本( 90％以上)。

原料成本和生产规模成正比，因而随着生产规模的放大，总成本也增加很大。

而传统的分离方法中，总成本主要是设备投资，并且设备投资并不与生产规模成正比。

因而是的大规模生产时双水相萃取技术没有优势可言。

因此降低成相物的成本是双水相萃取技术工业化应用的关键。

四、双水相体系的构成1、双水相体系的形成A、高聚物/高聚物体系作为一种体系，也就是说它是一个系统，在无外界干扰的情况下，系统的能量总要趋向于最低状态。

对于双水相体系目前主要有两种解释法：一种认为两种聚合物相互混合时，究竟是否分层还是混成一相，主要取决于两种因素，即分子间作用力和熵的增加。

两种物质混和时熵的增加与涉及的分子数目有关，同分子大小无关。

但分子间的作用力，可以看作分子中各个基团之间相互作用力的总和，分子越大当然作用力就越大。

可见对于大分子而言决定混合的结果主要取决于分子间的作用力，而不是熵增。

若两种聚合物分子间若表现为排斥力，即某种分子希望在它的周围的分子系同种分子而非异种分子，则达到平衡后，就有可能分成两相。

若存在引力，或同种分子引力或异种分子斥力不够强，则会混容或很难形成两相。

另外一种就简单的归结为分子间的空间位阻，即在一定条件下，由于高聚物分子的空间阻碍作用，无法互相渗透形成均相，具有相互分离倾向而形成两项系统。

若从混合前后能量的高低来解释就更好理解。

假设有两种物质，物质A 要进入物质B 的体系中，首先要克服它本身分子间的作用力，假设所需能量为E1，然后需要B克服的空间位阻，即B物质要分开留出一定空间来容纳物质A，假设所需能量为E2,混合后，AB物质相互作用，假设释放的能量为E,如果E什E2>E, 则表现为不相容，分为两相；若E计E2<E，则表现相容，体系不分层。

可以看得出，这很好地从分子间的作用力和空间位阻两个方面解释了双水相体系的形成原理。

B、高聚物/无机盐系统高聚物和无机盐形成两相系统比较一致的解释是盐析作用。

C、生化分离常见的体系聚乙二醇(poly ethylene glycol PEG) /葡聚糖(Dextran DEX)系统PEG/DEX 硫酸盐系统PEG/硫酸盐系统PEG/磷酸盐系统实验证明这两种聚合物对生化活性物质无毒害作用，反而起到保护作用，使分子结构更稳定。

2、相图（作图说明）A、双节线TCB将单相区和两相区分开，曲线下方是由两种高聚物混合溶液组成的均相体系，曲线上方是由两种高聚物溶液组成的双水相体系。

B、直线TMB称之为系线，系线上的所有点构成的双水相体系的组成相同，但体积比不同。

C、T和B点分别代表上下相两种高聚物的质量百分组成。

D、由于上下两相密度差别不大，则有V T/V B=BM/TME、C点表示系线长度为零，代表两相差别消失或者说两相即将形成的点，称之为临界点（critical point）或褶点（plait point）F、双节线的位置和形状与聚合物的分子量有关。

聚合物的分子量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物分子量的差别越大，双节线的形状越不对称。

见图①B五、双水相萃取分配理论基础双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同（一个两相都是水溶液，而另一个一相是水溶液，另一相是有机溶液）。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中分配的浓度不同。

分配系数K等于物质在两相的浓度比，即K = C1/C2。

（C i一般表示上相，C2 一般表示下相）因为各种物质的K值不同，可利用双水相体系对物质进行分离提纯。

1、表面自由能的影响众所周知，当体系达到平衡时，分子处于某一相时若能量低，贝U它会比较集中地分配到该相中。

设分子自相2移到相1所需能量为△ E,则根据相平衡时,化学位应相等的原则，可得到分配系数K应为:e 一灯式中：k—波尔茨曼常数；T—温度。

设某种被分离物质的分子表面积为A，则在两相中的表面能分别是A Y 1 和A 丫2,可得：-A( 1 2)kT分析上式可知分配系数主要取决于分子的表面积和表面性质(1) 、当分子在两相中的表面性质相同时，可知 K 二1,则这种物质在两相中的分配相同，这种系统不能将该物质提纯浓缩。

(2) 、当分子在两相中的表面性质不相同时，则 K 工1,若差别越大，K 值就 会越小或是越大，即C i 和C 2的差值就越大，就更有利于该物质的提纯浓缩。

(3) 、从表面积来说，A 值越大，会导致C i 和C 2的差值就越大。

一般来说， 分子量和表面积成正比，所以从理论上来说，利用双水相系统分离大分子物质是 很合理的。

(4) 、另外，对于一个待分离的混合溶液来说，由于各种物质分子的表面积-A （ 1 一 2 ）kT不同，且在两相中的表面性质也存在差异, 从而在双水相体系中能达到提纯的作用2、表面电荷的影响对于带电物质的正负粒子，当在两相中分配系数 差，称之为道南电位(Donnan potentin )当两相分配达到平衡时，经推导得到如下式子：可见可以通过加入带电粒子来改变两相的电位差, 配系数。

六、影响分配的因素1、聚合物的分子量 根据表面自由能的理论,-A （ 1 一 2 ）kT我们知道可以通过改变表面张力的大小来改变分子的分配系数。

比如用PEG/DEX 系统提取蛋白质，如果想让蛋白质分配在上相，则要求 K 增 大，蛋白质表面积A 不变，从而要求丫 1 — 丫减小2，也就是说要降低蛋白质在上 相(主要含有PEG )的表面张力，提高在下相(主要含有 DEX )的表面张力。

而表面张力的大小同聚合物分子量大小有关， 分子量越大，其端基数目减少，导 致疏水性增加，从而使表面张力增大。

因此需要降低PEG 的分子量，增大DEX 的分子量。

当聚合物的分子量降低时，蛋白质易于分配富含该聚合物的相中，这是一条 普遍规律，不论何种成相聚合物系统，何种进行分配的生物高分子都实用。

2、聚合物浓度的影响(1) 、当聚合物处于双节线以下时，被分离物将均匀分布于溶液中。

(2) 、当超过双节线，则形成两相，此时随着聚合物或盐浓度的不同变化， 双水相系统的性质将发生较大的变化。

因此可以通过改变聚合物或盐的浓度来改 变物质在系统的分配系数。

一般说来，当系统远离临界点时，系统的表面张力将所以其分配系数K 值也不会一样, K 不相等时，就会产生电位 U 2 -U 1 一「n笛 从而影响物质在两相中的的分增加。

(画相图解释)？？？？？？？？？？？？？？3、盐类的影响由于各种无机离子在PEG/DE冷配系数的不同，当加入无机盐后，将在两相间形成不同的电位差，这对带电生物大分子的分配产生很大的影响。

见表①C例如：NaCI对卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响，(作曲线图解释，见图①C)另外，HPO「离子在PEG/DEX系统中的分配系数很小，因而加入PH大于7 的磷酸盐缓冲溶液能很方便地改变相间电位差，使带负电的生物大分子移向PEG 相。

4、pH值的影响影响所分离分子的离解度，导致分子所带电荷的性质的改变，从而改变了这种分子在两相中的分配系数。

影响磷酸盐的离解度，若改变HPO42－和H2PO4－之间的比例，使相间电位发生变化，从而影响分配系数。