采用PCR-RFLP技术在不同水平上鉴定大豆根瘤菌
利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究
利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究大豆作为世界上最为重要的一种经济作物,每年在各个国家都有大宗的贸易份额,在其生长过程中会受到多种真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫等病原物的侵染。
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)均是危害大豆的重要病毒,也是我国的主要检疫对象,建立其多重PCR的快速检测体系,提高病毒的检测效率,为快验快放服务。
本研究以带有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆种子为实验材料,根据BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因设计合成多对引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,同时选择大豆内源基因(BD30K)作为参照物,确保RNA提取、cDNA第一链合成及PCR等过程被正确操作,防止假阴性结果的发生。
在此基础上合理组合各对引物并调整、优化多重PCR反应条件,最终确立了四对特异性引物和多重PCR的反应条件,选用的引物分别可扩增BPMV 275bp,TRSV 580bp,ToRSV 794bp,BD30K 104bp的特异性片段,反应条件则在普通PCR的基础上调整反应缓冲液浓度至1.4X,BD30K的引物浓度为其他引物的2倍,在此条件下我们建立了同时检测大豆种子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆内源基因BD30K的多重RT-PCR体系。
研究结果表明,同步检测的特异性和灵敏度均好;能够检测到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最低含量分别为0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng;携带三种病毒的大豆种子混合后提取的RNA的最低检测含量为1.16ng。
表明建立的多重PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可操作性强,大大缩短了检测时间,简化了操作步骤,具有较强的应用价值,适合口岸对进境大豆种子中这3种病毒的快速检测,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。
大豆根瘤菌共生基因的筛选以及三型分泌系统效应分子的鉴定
功能验证：通过基因敲除、 过表达等方法，验证三型 分泌系统效应分子的功能
鉴定过程
01
筛选大豆根瘤菌共生基因
03
鉴定效应分子的功能
05
确定效应分子的表达调控
0 2 提取三型分泌系统效应分子 0 4 验证效应分子的作用机制 0 6 研究效应分子的应用前景
鉴定结果
筛选出多种三型 分泌系统效应分
子
发现这些效应分 子在大豆根瘤菌
共生中的作用
鉴定出这些效应 分子的功能
鉴定结果对大豆 根瘤菌共生研究
的意义
结果分析
筛选出三型分泌系统 效应分子
分析三型分泌系统效 应分子对大豆根瘤菌
共生的影响
鉴定出三型分泌系统 效应分子的功能
探讨三型分泌系统效 应分子在大豆根瘤菌
共生中的作用机制
共生基因与三型分泌系统效应 分子的关系
三型分泌系统效应分子的鉴定 结果：通过实验鉴定出三型分
泌系统效应分子。
共生基因的筛选结果：通过实 验筛选出与大豆根瘤菌共生相
关的基因。
共生基因与三型分泌系统 效应分子的相互作用：分 析共生基因与三型分泌系 统效应分子之间的相互作
用关系。
结论总结
共生基因的筛选可以揭示三 型分泌系统效应分子的功能。
大豆根瘤菌共生基因与三型 分泌系统效应分子之间存在 密切关系。
基因克隆：将分离出的共生基 因进行克隆，以便进一步研究。
基因功能分析：通过基因敲除、 过表达等方法，分析共生基因 在大豆根瘤菌共生中的功能。
筛选结果
筛选出多个与大 豆根瘤菌共生相
关的基因
筛选结果有助于 进一步研究大豆 根瘤菌共生机制
基因的功能和作 用机制得到初步
大豆根瘤菌试验方案1
大豆根瘤菌试验方案1大豆根瘤菌在依兰农场试验总结王继华二OO九年十一月十日大豆根瘤菌接种是一项增产节肥、投资少、收益大、简而易行的措施。
是降低大豆生产成本。
提高大豆产量的有效措施。
它对于大豆有两个方面的作用。
一是通过将空气中丰富的氮素资源转化为大豆可以直接利用的铵态氮，解决大豆的氮肥供应；二是根瘤菌分泌的酶，促进大豆的生长发育。
一、试验目的通过试验，检验大豆根瘤菌在不同地区的固氮效果，及其对大豆的增产效果的作用。
二、试验方法。
采用小区试验和生产田对比试验同步进行。
1、基本情况2009年试验在依兰农场第五居民组的7-3号地，第七居民组的5-1号，为东经129°25′20″—129°38′20″，北纬46°23′15″—46°35′40″。
土壤均为草甸土及暗棕壤土。
地势平坦，土壤肥力中上等，土壤养分含量为有机质3.4%，速效氮125.28mg/kg，速效磷23.83mg/kg，速效钾72.63mg/kg。
前茬为玉米，原垄卡种。
生育期期间降雨量为491.90lm。
2、试验材料根瘤菌包衣剂，由河北省秦皇岛领先科技发展有限公司提供；用菌量225ml/垧供试大豆品种：垦丰16号，亩保苗1.8万株；播种量为50kg/垧。
3、试验设计试验设5个处理，三次重复。
小区随机区组排列，每个处理5行，行长10米，行距65cm，垄上播双行，5月2日播种施肥，播前精细整地，机械精量播种。
其它田间管理按三垄栽培技术规程操作。
对照1、常规施肥；（尿素2.6kg、二铵13.3kg、硫酸钾3.3kg）对照2、常规施肥，1kg种子用3ml根瘤菌液，伴匀后播种；对照3、在处理2的基础上，将常规施肥中的尿素减掉；对照4、在处理2的基础上，将常规施肥中的尿素减掉1/2；对照5、在处理2的基础上，将常规施肥中的尿素减掉1/3；三生育期调查1、出苗期：5月15日；初花期：6月27日；盛花期：7月13日；结荚期：7月21日；鼓粒期：8月9日；成熟期：9月18日；大豆根瘤菌固氮试验初花期、盛花期调查2、初花期从干物质积累调查表明，处理5拌种初花期表现地上、地下部的干、鲜重均占第一，鲜重比对照高8.3%，干重高46.2%，植株茎秆强壮，叶色浓绿，长势旺。
大豆疫霉拮抗菌株的筛选与鉴定
大豆疫霉拮抗菌株的筛选与鉴定付红梅1，李淼1，檀根甲1*，王子迎2，赵平生2（1．安徽农业大学植物保护学院，安徽合肥230036；2．合肥师范学院生命科学系，安徽合肥230601）摘要［目的］筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌，为寻找病害防控措施、设计新的疫病控制策略提供基础。
［方法］从黑龙江省3个不同地区采集大豆根围土壤样本并分离各类土壤微生物，采用对峙培养法筛选出对大豆疫霉有拮抗作用的微生物，并在此基础上测定拮抗力较强微生物对大豆疫霉菌的生长抑制率及其对大豆疫病的控制作用。
［结果］从土壤中分离得到1株拮抗效果相对较好的细菌，命名为B048菌株。
对峙试验结果显示，拮抗细菌B048菌株对大豆疫霉的生长抑制率达97．5%；拮抗持久力测定显示，在与大豆疫霉对峙培养21d 时抑菌带宽度仍达20．0mm ；在盆栽试验中，B048对大豆疫病的防治效果为100%。
经形态学和16S rDNA 序列分析，初步鉴定该拮抗细菌为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ）。
［结论］拮抗细菌B048菌株具有较好的开发成大豆疫病生物防治菌的前景。
关键词大豆疫霉；生物防治；短小芽孢杆菌；拮抗活性中图分类号S435．2文献标识码A 文章编号0517－6611（2011）19－11482－03Screening and Identification of Antagonistic Strain against Phytophthora sojae FU Hong-mei et al （College of Plant Protection ，Anhui Agricultural University ，Hefei ，Anhui 210095）Abstract ［Objective ］The paper was to screen the antagonistic strain against Phytophthora sojae with biocontrol potential ，and provide basis for searching control measures and designing new control strategies against P．sojae ．［Method ］The rhizosphere soil of soybean was collected from three different places in Heilongjiang Province ，and various soil microorganisms were isolated．Dual culture method was used to screenthe microorganism with antagonistic effect against P．sojae ．On this basis ，the growth inhibition rate of the microorganism with stronger antago-nistic effect against P．sojae was determined ，and its control effect against P．sojae was also measured．［Result ］A strain of bacterium with relatively good antagonistic effect was isolated from soil ，and named as strain B048．Dual test showed that the growth inhibition rate of antago-nistic bacterium B048against P．sojae reached 97．5%．Antagonistic endurance tests showed that the width of inhibition zone was still 20．0mm after dual culture with P．sojae for 21d．In potting experiment ，the control effect of B048against P．sojae was 100%．The antagonistic bacterium was primarily identified to be Bacillus pumilus through morphology and 16S rDNA sequence analysis．［Conclusion ］The antagonistic bacterium B048had good prospect to be developed as the biocontrol bacterium against P．sojae ．Key words Phytophthora sojae ；Biocontrol ；Bacillus pumilus ；Antagonistic activity基金项目国家自然科学基金项目（30800040）；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目；安徽省优秀青年科技基金项目（10040606Y04）。
大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定
大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定韩孝强（天津农学院农学系）1 前言根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌。
如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体[1]。
常制成细菌制剂即一种生物肥料在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段。
美国、澳大利亚、新西兰、日本、意大利、奥地利、加拿大、法国、荷兰、芬兰、泰国、韩国、印度及非洲的一些国家，至少有70多个国家研究、生产和应用豆科根瘤菌，不仅面积不断扩大，而且应用的豆科植物种类也日益繁多。
在美国、巴西等大豆种植的主要国家，根瘤菌接种率达到95%以上[2]。
世界各国一直在研究与豆科作物及其品种相匹配的优良根瘤菌生产用菌株，根瘤菌剂产品在稳步提高[3]。
我国微生物肥料的研究始于20世纪40年代，其研究与应用已有几十年的历史，在我国的农业生产中起了非常重要的作用。
最早研究应用的是根瘤菌制剂，代表和奠基人有张宪武先生、陈华癸院士和樊庆笙先生等[4]。
众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要[5]。
而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题[6]。
因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标[7]。
传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定[8]。
但近几十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定[9]。
大豆根瘤菌的分离与分子鉴定
第19卷第5期黑龙江八一农垦大学学报19（5）：16～19文章编号：1002-2090(2007)05-0016-04大豆根瘤菌的分离与分子鉴定高亚梅，韩毅强，王景伟，汤辉，孙东梅，王彦杰，王伟东（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院， 大庆 163319）摘要：为进一步发掘新的根瘤菌资源，丰富和充实根瘤菌资源库，本研究采用平板分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌，获得的菌株进行盆栽回接试验，结果表明分离获得的5株根瘤菌代表菌株均可在大豆上结瘤，具有结瘤能力。
根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nodA保守区域设计引物对其进行了分子鉴定均获得了nodA PCR 扩增产物，从而在分子水平上实现了对根瘤菌的快速鉴定。
关键词：大豆；根瘤菌；回接鉴定；共同结瘤基因nodA中图分类号：S154.381 文献标识码：AIsolation and Molecular Identification of Soybean RhizobiaGAO Ya-mei, HAN Yi-qiang, WANG Jing-wei, TANG Hui,SUN Dong-mei, Wang Yan-jie, WANG Jing-weiAbstract: In order to discover new soybean rhizobia resource and screen highly efficient soybean rhizobia for our region, soybean rhizobia was isolated and purified from soybean nodule by plating and the strains isolated were used to carry out pot culture experiment. Results showed that all the five representative strains gained could nodulate in soybean plant. Therefore all of them had the ability of nodulation. PCR amplification of common nodulation gene nodA was carried out using primer designed acoording to the conserved region of nodA. All the representative strains got nodA PCR products. Therefore the characteristics of strain nodulation belonging to rhizobia could be judged quickly from nodA at the level of molecule.Key words:soybean; rhizobia; re-inoculation and identification; common Nodulation Gene nodA0 前言根瘤菌(rhizobia)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其侵染豆科植物根部或茎部后形成根瘤或茎瘤，以共生体形式固定空气中的N2为植物可吸收利用的NH4+。
生物博士论文大豆根瘤菌共生基因的筛选以及三型分泌系统效应分子的鉴定
生物博士论文大豆根瘤菌共生基因的筛选以及三型分泌系统效应分子的鉴定生物博士论文：大豆根瘤菌共生基因的筛选以及三型分泌系统效应分子的鉴定引言：大豆根瘤菌是一种重要的土壤细菌，与大豆植物之间形成共生关系。
在这种共生关系中，大豆根瘤菌通过与大豆根部结合，并形成根瘤，从而利用植物根系提供的营养物质，同时为植物提供固氮能力。
这种共生关系对于大豆的生长发育和农业生产具有重要意义。
本论文旨在通过筛选大豆根瘤菌共生基因以及鉴定三型分泌系统效应分子，深入探究大豆根瘤菌与植物之间的共生机制。
一、大豆根瘤菌共生基因的筛选1. 共生基因的重要性大豆根瘤菌的共生基因在共生过程中起到关键作用，它们调控着根瘤的形成、发育以及与植物之间的信号交流。
因此，筛选和鉴定这些共生基因对于揭示共生机制具有重要意义。
2. 筛选方法为了筛选大豆根瘤菌的共生基因，我们采用了基因组学和转录组学的方法。
首先，通过对大豆根瘤菌的基因组进行测序，得到了其基因组序列。
然后，利用生物信息学工具对基因组数据进行分析，筛选出与共生相关的基因。
同时，我们还通过转录组学方法，研究在共生过程中基因的表达变化，进一步筛选出与共生相关的基因。
3. 共生基因的功能研究通过对筛选出的共生基因进行功能研究，我们可以深入了解这些基因在共生过程中的作用机制。
例如，我们可以通过基因敲除实验来验证某个基因对于根瘤形成的影响，或者通过基因表达实验来研究某个基因在共生过程中的表达模式。
二、三型分泌系统效应分子的鉴定1. 三型分泌系统的作用三型分泌系统是一种细菌特有的分泌机制，通过该机制，细菌可以将一些效应分子注入到宿主细胞内，从而影响宿主细胞的信号传导和免疫反应。
在大豆根瘤菌与植物共生过程中，三型分泌系统起到了重要的作用。
2. 鉴定方法为了鉴定大豆根瘤菌的三型分泌系统效应分子，我们采用了多种实验方法。
首先，通过基因组分析，筛选出可能与三型分泌系统相关的基因。
然后，利用融合蛋白技术，将这些候选基因与荧光蛋白等标记融合，观察其在宿主细胞内的定位。
高效大豆根瘤菌筛选的初步研究
高效大豆根瘤菌筛选的初步研究吴萍;何庆元;李正鹏;史钧;祝嫦巍【摘要】采用CR-YMA培养基对新鲜的大豆根瘤提取物进行根瘤菌的分离、纯化培养,获菌落为圆形乳白色,表面凸起,直径0.4 ～0.5cm,革兰反应阴性,显微观察显示为短杆状的根瘤菌26株,并对26个菌株进行蛭石盆栽试验,接种效果显示:接种根瘤菌的大豆植株都有结瘤；与对照相比在结瘤数、鲜瘤重、瘤干重及植株地上部分干重分别增加了14.6％～ 1330.4％,6.3％～461.9％,28.6％～492.9％,10.2％～86.3％,植株全氮量在9.188％和12.563％之间.初步筛选出与大豆品种“南农1138-2”最佳共生匹配的根瘤菌菌株分别是:AF1、AF9、AH10.【期刊名称】《安徽科技学院学报》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】4页(P29-32)【关键词】根瘤菌;大豆;共生固氮;筛选【作者】吴萍;何庆元;李正鹏;史钧;祝嫦巍【作者单位】安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳 233100;安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳 233100;安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳233100;安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳 233100;安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳 233100【正文语种】中文【中图分类】S182根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它能侵染豆科植物根部后形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。
因此，研究和利用根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系，在减少化学氮肥施用、保护生态环境、促进农业可持续发展等方面均有重要意义［1－3］。
大豆与大豆根瘤菌的共生体系是其中的典型代表，我国又是大豆和大豆根瘤菌的起源地之一，对该共生体系开展根瘤菌与大豆品种的匹配性组合研究，具有重要的实践价值。
研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［4－8］。