分子克隆基本操作
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
分子克隆的基本步骤
分子克隆的基本步骤嘿，各位科学小达人，今天咱们就来聊聊分子克隆的基本步骤，这可是实验室里的“高级魔术”，我保证，听完我的讲解，你也能变成一个“DNA巫师”。
首先，得准备好我们的“魔法材料”，也就是那些瓶瓶罐罐里的“液体宝贝”。
什么“PCR试剂”、“限制酶”、“连接酶”啦，这些都是我们“克隆大业”的必备良药。
第一步，来个“DNA热舞派对”，也就是PCR扩增。
把我们的目标DNA扔进“PCR机器”里，让它跟着高温曲线一起“热舞”，直到它“子孙满堂”，复制出成千上万的DNA副本。
第二步，给DNA来个“精致修剪”，这就是传说中的“酶切反应”。
我们用限制酶这个“分子剪刀”把DNA切成我们想要的形状，这可是个精细活儿，稍微手一抖，就可能变成“DNA碎片”。
接下来，是“DNA联姻”环节，也就是“连接反应”。
我们把修剪好的DNA片段和载体DNA“牵线搭桥”，让它们在连接酶的“见证”下，成为“一家人”。
这就像是在实验室里举办了一场“分子婚礼”。
然后，是“细胞变身”时间，也就是“转化反应”。
我们把连接好的DNA“送入”细菌细胞，让它们变成“DNA搬运工”。
这个过程就像是在细胞界搞了一场“特工行动”。
紧接着，得来个“D NA身份验证”，也就是“筛选转化子”。
我们把这些“可能怀孕”的细胞放在含有抗生素的培养基上，只有那些成功“怀孕”的细胞才能存活下来，这就像是在玩“细胞版”的“谁是卧底”。
最后，我们要进行“DNA产前检查”，也就是“DNA测序”。
通过测序，我们可以确认我们的克隆是否“健康成长”，没有出现“基因突变”这类“家庭悲剧”。
总之，分子克隆这事儿，听起来高大上，其实就是一场实验室里的“魔法表演”。
只要掌握了这些“咒语”和“魔法棒”，你也能在DNA的世界里，玩转“克隆大法”。
别忘了，每个科学家心里都住着一个小巫师，分子克隆，只是我们施展魔法的一部分！。
分子克隆的基本流程
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分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
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分子克隆基本操作
一、PCR（聚合酶链反应）扩增体系
实验成分加入量（ul）终体积
模板DNA 0.1
dNTP 0.4
上游引物（P1）0.5
下游引物（P2）0.5 20 ul
10×Taq Buffer 2.0
TaqDNA聚合酶0.1
ddH2O 16.4
PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸3个步骤组成的不断重复过程：
反应条件
PCR反应变性退火延伸循环周期１940C预变性5min 1
２940C 1 min 50~570C1 min 720C 1 min 25~35 ３720C 5min
(反应结束后，样品可与40C暂存)
二、PCR产物的凝胶电泳检测
1.1%琼脂糖凝胶配制：
配胶：将卡子放于制胶器孔中；
称取0.3g琼脂糖溶于30ml 1×TAE之中置于微波炉中煮沸三次；
倒胶：待温度降低600C左右时（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB 至终浓度0.5ug/ml（30ml凝胶1.5ulEB）,摇匀后缓慢倒入制胶器中。
避免产
生气泡，尤其注意梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管吸去。
凝胶条件：在室温中放置30~45min.。
拔梳子：小心垂直拔出梳子，保持点样孔完整。
2.加样：
凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm。
将PCR产物与6×加样缓冲液，混合均匀加至加样孔中。
同时，根据待分离片段的大小选择不同的DNA分子量标准作对照。
加样孔处于电泳槽的阴极端。
（加样是勿碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐。
）
3.电泳：
接通电源，开启电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，且负极比正极气泡多，设置电泳电压及电泳时间（电泳时间视具体样品而定，一般15~30min）。
4. 拍照：
胶置于凝胶成像分析仪中，根据图片用途调整焦距及灯光。
三、DNA切胶回收
1.切胶: 于紫外灯下确定欲回收的DNA片段，取干净EP管称重m1标记，用
手术刀切下含有目的DNA片段的凝胶块，置于EP管中。
（观察和切胶含目的DNA片段的凝胶时，紫外灯照射时间不宜过长，以减少紫外线对DNA的损伤、剪切或引起基因的突变。
）
2.称总重m2，则胶重为m2-m1, 按胶重量加入Binding Buffer。
3. 将EP管置于55-65℃水中融化7min, ,每2-3min震荡一次。
4. 将混合液体加入HiBind管柱中室温离心10000*g 1min 弃取收集液。
5. 加入300ulBinding Buffer洗柱离心10000*g 1min。
6. 加入700ulSPW Wash Buffer, 室温放置2-3min, 离心10000*g 1min 弃取收集液。
7. 重复⑥
8. 空柱离心10000*g 1min,充分干燥柱上的DNA,弃取收集液。
9. 将柱子移入空1.5mlEP管中,加入20ulDNA Elution Buffer, 离心10000*g 1min。
四、建立酶切体系
目的片段酶切体系
实验成分加入量（ul）
胶回收产物 5.0
酶切酶1 0.5
酶切酶2 0.5
Buffer 2.0
ddH2O 2.0
克隆性基因载体的酶切体系
实验成分加入量（ul）
克隆性基因载体（质粒） 2.0
酶切酶1 0.4
酶切酶2 0.4
Buffer 2.0
ddH2O 5.2
五、凝胶电泳检测及胶回收
同二、三两步
六、目的基因与克隆载体的体外重组（连接）
实验成分加入量（ul）
目的基因胶回收产物5~7
克隆性基因载体胶回收产物 1
水浴450C 5min 冰水浴00C 3min(静置)
T4 Ligase 1
10* T4 Ligase Buffer 1
160C过夜
七、重组克隆基因引入受体细胞（转化）
⑪、-70℃取出TOP10 50uL（置1.5ml EP管中），立即冰水浴10min。
⑫、加入5uL上述连接产物，轻轻混匀（在超净台中完成）。
⑬、放入0℃冰水浴30min（放于4℃冰箱）。
⑭、而后放入水浴锅中42℃热休克90秒（严格控制时间）,转入0℃冰水浴3min。
⑮、加入800ul LB培养液，置摇床37℃孵育45min-1h。
⑯、将其取出，5000rpm离心5min，弃上清留约100uL残液均匀涂于LB平板上(LB平板预先烘干)置37℃培养箱中培养12-16h.
八、含目的基因重组体的筛选（挑单克隆菌落）
取出上述LB平板置于超净台中，并同时取试管架,EP管架各一只、LB培养液一瓶（个人专用）、氨苄青霉素（AM P﹢）。
⑪、点燃酒精灯，取干净试管（数目依据欲挑菌数）。
⑫、每管加入5mL LB培养液（无菌操作）。
⑬、分别加入5uL氨苄青霉素（AM P﹢）。
⑭、挑单个菌体，用移液器枪头（或接种棒）轻挑放入试管中（试管要倾斜，切勿将移液器放入试管中）塞上试管塞，之后平板放置4℃冰箱保存。
⑮、置于37℃摇床，摇菌12-16h。
⑯、摇菌5h后可以进行菌液PCR鉴定
九、重组质粒的制备（小提质粒）
重组质粒的少量制备按OMEGA bio-tek公司的质粒少量快速提取试剂盒操作.
①取一个新的 HiBind DNA结合柱装在收集管中，吸取200uL Buffer GPS平衡缓冲液至柱子中，室温放置3-5min，室温下，12000*g离心2min。
②取1ml菌液装于EP管中10000*g,离心10min,弃上清.
③加入250ul Solution I,重悬菌落,混合均匀. 加入250ul Solution II,轻轻地上下颠倒数次,而后静置2min. 加入250ul Solution III, 轻轻地上下颠倒直至白色絮状物形成为止.10000*g,离心10min.
④将③离心管中的清晰液体吸至HiBind柱中（切勿将白色絮状物吸入）, 10000*g,离心1min.
⑤弃去收集液,向HiBind柱中加入500ulBuffer HB, 10000*g,离心1min.（重复一次）
⑥弃去收集液, 加700ul DNA Wash Buffer, 10000*g,离心1min.
⑦重复⑥步
⑧空柱13000*g,离心2min,充分干燥柱子.
⑨.把柱子移置洁净的1.5EP管中,加入15-30ul Elution Buffer，室温静置两分钟,12000*g 离心2min.（将收集液从新吸入柱子，12000*g离心2min）。
⑩4℃暂存，-20℃长期保存.
十、双酶切鉴定
建立酶切体系:
成分用量
质粒 2.0ul
酶 1 0.5ul
酶 2 0.5ul
Buffer 1.0ul
ddH2O 6.0ul
总计 10ul体系
酶切条件:37℃水浴4h取全量酶切产物以2000DL为Marker,1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。
十一、测序。