等电聚焦电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis,IEFE
等电聚焦电泳(最新)
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进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重 复性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经 分离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的 区带
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（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
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㈡引入电场时的变化
载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。
其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其 次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电 荷被减少到零才停止。
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pH
ApH=pH’
+
b
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-
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当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝 负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
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pH
pH=pH’ A+
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
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pH梯度形成的过程
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㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
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生物化学名词解释
生物化学名词解释《生物化学》——名词解释氨基酸（amino acids）:是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连接在α-碳上。
氨基酸是肽和蛋白质的构件分子。
必需氨基酸（essential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸等氨基酸。
非必需氨基酸（nonessential amino acids）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
等电点（pI，isoelectric point）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。
茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。
肽键（peptide bond）：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合，除去一分子水形成的酰胺键。
肽（peptides）：两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。
蛋白质一级结构(primary structure)：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。
层析(chromatography)：按照在移动相（可以是气体或液体）和固定相（可以是液体或固体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。
离子交换层析(ion-exchange column chromatography)：使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。
透析（dialysis）：通过小分子经半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)：也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳 介绍
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳
电聚焦电泳（Electrophoretic Focusing，EF）是一种用于实现
高灵敏度、高精度分子体系和复杂生物分子分离分析的分子生物技术。
它把目标分子样品流经电泳液体，有效地将它们隔离到不同的位置，
这样就可以根据它们的大小、结构以及分子量等不同而被分开。
相比
具有选择性分离力的磁聚焦，EF分离的结果更快、更准确，可以易于
扩展和实现，并且对于体积小的细胞样品具有较强的灵敏度。
电聚焦电泳的原理是根据移动的电势差分离电荷相同的分子。
当
电荷相同的分子分离时，电荷混合物会电离，电脉冲时会产生一层聚
焦薄膜，把目标分子固定在内部，从而形成一个特定的分子群。
同时，该分子群会以均匀的速度实现空间上的分离。
电聚焦电泳的应用非常广泛，可以用于检测RNA、DNA、蛋白质、小分子微粒及细胞分子。
电聚焦电泳还能用于测定电荷的究竟引起什
么样的分布；测定环境中电荷的分布及分离度；克隆和检测RNA、DNA、蛋白质及小分子微粒等。
同时，电离力学也能够测量空气微粒中非饱
和状态的水汽分布状况以及其对应的稳定性能等。
电聚焦电泳的灵敏度可以加强样品的分离和分析效果。
近年来，
众多研究人员利用电聚焦电泳进行精确的分析和实验，从而推动该技
术的发展。
电聚焦电泳的应用不仅仅可以操作小分子，也可以为更大
分子的实验提供便利。
随着电聚焦电泳在实验领域的不断发展，它在
生物分子分离与分析方面将有着广泛的应用。
等电聚焦原理
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 分子的两性电解质的混合物所组成的 ， 设其中某一成分为A 它的pI=pH’ 设其中某一成分为 A， 它的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’ 它带负电荷， 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。 极移动。(图b)
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 分析分离制备蛋白质、 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 csf中寡克隆区带的检测 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 测定pI可鉴定蛋白质 可鉴定蛋白质、 3.双相电泳中，IEFE作为第一相 双相电泳中，IEFE作为第一相
3.其它检测方法 3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 电聚焦有高的分辨力， 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀， 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 预先除去。 蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。 占据了分离的有效部位。
pH
pH=pH’ A+ +
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解 质也会各自迁移到它们的等电点处， 质也会各自迁移到它们的等电点处 ， 由于 它们的数量足够多， 它们的数量足够多 ， 各自的等电点相差很 从而形成一个pH梯度 梯度。 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳等电聚焦电泳（dielectrophoreticfocusing）是一种用于细胞、分子、纳米颗粒和其他微流体的微流控技术，通过利用非线性电势场的电力作用力而形成。
等电聚焦电泳被广泛应用于医学、生物、农业等领域，用于扩大细胞、分子的空间分布，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离等。
等电聚焦电泳技术是借助电力作用力而产生的，它可以控制和操纵介观尺寸细胞及其他形态、性质及体积的微流体，并将它们集中在一定的位置上，使得它们可以形成一个固定的浓度差，从而有效地改变细胞组织或分子组织。
此外，等电聚焦电泳可以将细胞和分子单独分离，用于研究其功能、形态和特性，对细胞组织的分离比传统的手工分离有更高的灵活性和精确度。
等电聚焦电泳技术主要包括三个关键步骤：电场的制备，细胞或分子组织的悬浮和集中以及离心纯化等步骤。
首先，电场的制备涉及制造一个稳定的电场，也就是控制静电场的强度，以及形成旋转电场的大小及方向，以使细胞或分子组织能够在最佳的条件下在电场中运动。
其次，通过几种方法将细胞或分子组织悬浮在溶液中，并且在电场中形成一定的浓度差。
最后，采用离心力来调节浓度差，以集中细胞或分子组织。
等电聚焦电泳技术有许多优势可以利用，其中最大的优势是可以在低成本、高效率和高精确度的情况下分离细胞、分子和纳米颗粒。
等电聚焦电泳技术也具有较强的灵活性，可以根据实验需求设计合适的电场，以实现一些特殊的功能要求，例如分离染色体、调整细胞的形态和性质、对微流体进行排序，并且可以在体外环境实现实验工作，不会受到体内环境的限制。
等电聚焦电泳技术是一种重要的技术，它可以确保细胞、分子和纳米颗粒的有效分离，有助于研究各种特定类型的细胞及其功能，也可以用于分离细胞组织或分子组织，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离。
随着技术的进步和发展，等电聚焦电泳技术的应用也会越来越广泛，在不久的将来会得到更多的应用，有助于推动科学和技术的发展。
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的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，
不干扰样品的测定。
2.载体两性电解质的合成
蛋白质分子的电聚焦过程
+ +
pH=pI
-
—
a
b
c
a.
蛋白质分子在负极端
b.
蛋白质分子在正极端
c.
蛋白质样品中各组分聚焦成区带
pI1 pI2
pI3 pIn
在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电 场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质 带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移 动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来， 即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质(ampholytes)混合物建 立稳定良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
（一）优点
High Resolution High Sensitivity Good Reproduction
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
分辨率(resolution)较不连续PAGE更高， 特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不 同的生物大分子。
（二）支持介质(medium)的选择
作用：防止扩散 抗对流
liquid medium：蔗糖、Ficoll gel medium：agarose、sephadex、PAG
（三）聚焦后的检测方法
各种染色法 扫描与定量 其它检测方法
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
Q M = ——
6r
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
三、IEFE的基本原理
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+
P
P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 COO-
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形 成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加 的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高 pH区。
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
Ampholine（LKB）
本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多 氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相 同又十分接近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是一 系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH 梯度(pH gradient)。
当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移 动，直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由 于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力， 因此在它附近形成一个pH稳定区域。
同样载体两性电解质(carrier ampholytes) 中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点 (isoelectric point,pI)处，由于它们的数量足 够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个 pH梯度。
The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding必须具备3个条件：
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等 电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质 的电泳技术。
考马斯亮蓝
银染
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
实验 血红蛋白的等电聚焦电泳
Hb具有四条多肽链 （α、β、γ、δ）
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。
HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
其次一些低pI的载体两性 电解质分子（荷其次多的负 电）也将向阳极移动，直到 它的净电荷被减少到零才停 止。
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质
(carrier ampholytes)分 子以增加pI级数的办法将 分别在阳、阴极之间到达 它们自己的位置而给出一 个pI梯度。
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：
㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解
质
(Carrier
ampholytes) 分 子 都 荷电，只是溶液中荷 正电和荷负电的基团 数目相等，净电荷 (net charge)为零。
㈡引入电场时的变化
载 体 两 性 电 解 质 (carrier ampholytes)分子将向阴极 (cathode) 或 阳 极 (anode) 迁移，带有最低等电点的分 子（荷最多的负电）将最快 地向阳极迁移。当它达到净 电荷是零的位置时才停止。
即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度， 在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于 其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一 个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称 为聚焦电泳。
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
二、IEFE的特点
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
四、IEFE的应用 Applications of IEF
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第一相
双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另 外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放 的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化
由于载体两性电解质(carrier ampholytes) 是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组 成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’， 当环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。
HbF
1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要 成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为 HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的 浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数 正常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成 人的正常浓度，以后HbF一直存在。
[器材]
电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是
在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质
[试剂]
Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）
[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
[结果]
pI HbA 6.87
HbF 6.98
HbA2 7.38
[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？
2.本实验的关键步骤是什么？