动物细胞培养的方法
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
•
•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
第三章 细胞工程(三)
缺点：
存在扩散限制，颗粒太大时细胞生长不 良； ② 培养过程中忌钙沉淀剂或整合剂 ，如磷 酸盐、柠檬酸盐、EDTA等均会使凝胶溶 解。
①
3.抗凋亡技术
细胞凋亡，是指为维持内环境稳定，由 基因控制的细胞自主有序地死亡。 细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的 最大障碍，死亡的细胞80%是凋亡所导致， 而不是坏死。因此抗凋亡技术的应用在 细胞大规模培养中显得极为重要。
3.灌流式操作
灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面 新鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应 液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使 细胞处于一种不断的营养状态。 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件 较好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～ 108个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低 温下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提 高，生产成本明显降低。
中 试 生 物 反 应 器
动物细胞融合
细胞融合是正Байду номын сангаас的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合又称细胞杂交。是指将二种或二 种以上的细胞或原生质体合并形成一个细 胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞 的方法。
自然融合 自然情况下发生的融合 人工诱导融合 在体外用人工方法促使融合
细胞融合技术
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
聚乙二醇 （PEG） 法细胞融 合过程
电融合 诱导法 原理示 意图
动物细胞融合的过程
动物融合最成功的例子就是“杂交瘤”— —能够产生单克隆抗体的融合细胞。
植物细胞工程与动物细胞工程的比较
3.动物细胞生长特性：
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
1.2 动物细胞培养过程
胚胎或幼龄动物的组织器官
细胞悬液
动物细胞融合
单克隆抗体制备应用
胚胎移植
核 移 植
动物细胞工程概述
动物细胞培养
动物细胞工程
2.2 动物细胞工程
动物细胞工程常用的技术 单克隆抗体等 动物细胞培养 动物细胞核移植 动物细胞融合 是其他动物细胞工程技术的基础。
动物细胞培养和核移植技术
如何进行细胞培养?
1.1概念
1.动物细胞培养
动物细胞培养不能最终培养成生物体
细胞增殖缓慢，核型可能变化
动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。
贴壁生长 接触抑制
10代以内，保持正常二倍体核型
传代培养
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
原代培养和传代培养、细胞株和细胞系
无菌、无毒的环境
温度和PH
5+（-）0.5度
（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
（一）动物细胞培养
动物细胞培养液的主要成分：
添加标题
1
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。
添加标题
2
与植物培养基相比其特点是：
添加标题
3
（1）液体培养基
添加标题
4
工程动物细胞培养制药工艺过程
工程动物细胞培养制药工艺过程工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法。
该过程通常包括以下几个步骤：1. 动物细胞的选取和培养基的准备：首先，需要选择合适的动物细胞作为生产细胞株。
通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞等。
然后需要准备培养基，培养基中包含了生长和繁殖细胞所需的营养物质、生长因子和其他必要的成分。
2. 细胞的扩增和传代：将选取好的动物细胞接种在培养基中，通过提供适当的温度、pH和氧气浓度等环境条件，使细胞可以持续增殖和扩增。
当细胞达到一定的密度时，需要将其传代到新的培养器中，以维持细胞的生长状态。
3. 细胞的表达和分泌：在培养过程中，可以向培养基中添加适当的诱导剂，促使细胞表达和分泌所需的药物。
细胞内的基因表达会产生药物的前体分子，然后通过细胞分泌系统将其释放到培养基中。
此外，细胞内的代谢途径也会参与药物的合成和修饰。
4. 收集和纯化药物：当细胞分泌出药物后，需要对培养基进行采集和处理。
这通常包括离心和过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后可以通过柱层析、电泳或其他分离技术对药物进行纯化，以得到纯度较高的药物样品。
5. 进一步的处理和制剂制备：在得到纯化的药物后，可以进行进一步的处理和制剂制备。
这包括稳定性研究、配方优化和药物制剂的制备等。
最终，通过临床试验和质量控制等步骤，可以得到最终用于临床应用的制药产品。
总结而言，工程动物细胞培养制药工艺过程是一个复杂的生产过程，需要合理设计培养条件、监控细胞生长和药物表达等关键参数。
同时，也需要严格的质量控制和合规操作，以确保药物的质量和安全性。
这一过程在现代制药工业中扮演着重要的角色，为生产高质量的药物提供了可靠的方法。
工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法，广泛应用于药品研发和制造领域。
它比传统的化学合成方法更安全、高效，并能够生产出高质量的药物。
在工程动物细胞培养制药工艺中，动物细胞株的选取是至关重要的一步。
常用的五种动物细胞培养方式
•一、半连续式培养1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。
采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。
在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。
或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。
剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。
在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。
2.半连续式特点：·培养物的体积逐步增加；·可进行多次收获；·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。
该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。
二、连续式培养1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。
该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。
理论上讲，该过程可无限延续下去。
2.连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。
稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。
在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。
动植物细胞培养产酶
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d， 使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团 或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破 碎、提取、分离得到超氧化物式图
1.动物细胞培养的特点
•细胞生长速度慢。（需添加抗生素） •细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 •反应过程成本高，产品价格贵。 •细胞具有锚地依赖性。 •原代细胞一般繁殖50代。
愈伤组织：
将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左 右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小 细胞团。
外植体
水稻的外植体（幼 胚）和愈伤组织
愈伤组织
4. 培养条件的影响与控制
（1）温度 （2）pH （3）通气与搅拌 （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）刺激剂（elector）的应用
2.培养基特点
应用最广的是MS培养基和LS培养基
MS培养基是1962年由Murashinge和 Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS 培养基是在其基础上演变而来的。
3.培养方法：悬浮细胞培养
①细胞株的建立；外植体与愈伤组织 ②扩大培养； ③大罐培养；
外植体：
从植株取出，经过预处理后，用于植物组织 培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、 果实、种子等）的片段或小块。
动物细胞培养的基本方法
膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代 谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产 物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设 计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有 害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长 至更高密度，同时可根据需要选用不同相对 分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞 分离开。
第五节 动物细胞培养的基本方法
一 细胞分离
1 离心分离法
用于从含有细胞的体液如血液、羊水、 胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm 离心5～10min。
2 消化分离法
先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化 液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲 液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细 胞。 常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰 酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、 木瓜蛋白酶等。
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫
疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅 拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固 定床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
2 细胞的复苏
复温速率
复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。 一般来说复苏速度越快越好。 常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完 成复温。
第六节
动物细胞大量培养的 方法和操作方式
动物细胞大规模培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）， 在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大 量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目 前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴 肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、 cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细 胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依 赖)等。
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动物细胞培养的方法
动物细胞培养是一种在实验室中进行的细胞生物学技术，可以用来研究细胞的生长、分化、代谢以及毒性等方面。
一般来说，动物细胞培养需要以下步骤：
1. 选择细胞系：选择适合自己研究的细胞系，例如常用的HeLa 细胞、293细胞等。
2. 培养基配制：根据细胞系的需求配制适当的培养基，添加必要的营养物质和能量补给。
3. 细胞分离：用消化酶将组织细胞分离成单个细胞，避免细胞间黏连。
4. 细胞传代：当细胞密度达到一定量级后，需要将细胞传到新的培养皿中，以保证细胞的生长和繁殖。
5. 细胞存储：将细胞冷冻保存以备日后使用。
以上是动物细胞培养的基本步骤，当然在实际应用中还涉及到一些技术细节和技巧，需要不断摸索和实践。
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