《医学微生物学》实验五-抗酸染色与墨汁负染实验
微生物5 抗酸染色
原理：
由于分歧杆菌的胞壁含大量脂质，主要是分枝菌酸， 它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色， 可采用加温、延长着色时间或提高染料浓度等手段使其 着色。但分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂 脱色。故分歧杆菌又称为抗酸杆菌，这种染色方法又成 为抗酸染色。
延长时间：5min 提高染料浓度：初染用的酸复红浓度是革兰染色酸复红浓 度的10倍 盐酸酒精：脱色能力远远强于95%酒精
原理：
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌 酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒 精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分 枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物 质为兰色。
注意：不要使染液沸腾，若蒸发减少，可待玻片 稍冷却后适当补充。
（2）待玻片冷却后，用水缓慢冲洗，用吸水纸吸 干。
（3）脱色：滴加3%盐酸酒精，轻晃玻片，直至 无红色液体流下为止，一般作用1—3min*，水 洗，吸干。
（4）复染：用碱性美兰溶液复染1min，用水冲 洗后吸干。
（5）
*：不同文献报道不同，范围在30s至3min
П、漂浮集菌法。取晨痰2—3ml放入100ml三角瓶内，加1—2倍量 40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min）。 冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器 或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10— 15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15—20min，取 下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面 物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧 光染色，镜检。
Giemsa染色，X1000
恙虫热立克次体， X1000
5-111121-抗酸染色
微生物实验（ 微生物实验（五）
痰标本抗酸染色 厌氧菌形态培养 分枝杆菌培养 麻风杆菌形态观察
2011-11-21
（一）厌氧菌的形态培养
• 经呼吸道、接触感染 经呼吸道、 • 引起麻风病 瘤型麻风（开放型）： ）：传染性强 瘤型麻风（开放型）：传染性强 结核样型（闭锁性）： ）：传染性弱 结核样型（闭锁性）：传染性弱 • 微检：标本涂片抗酸染色是诊断麻风的 微检： 主要依据
28
麻风杆菌的抗酸染色
29
抗酸染色
原理： 一、原理：
• 抗酸性杆菌（结核杆菌、麻风杆菌等）的细胞壁内含有 抗酸性杆菌（结核杆菌、麻风杆菌等） 大量的脂质(主要是分枝菌酸) 包围在肽聚糖的外面， 大量的脂质(主要是分枝菌酸)，包围在肽聚糖的外面， 所以分枝杆菌用一般染色不易着色，需用强染剂（5%石 所以分枝杆菌用一般染色不易着色，需用强染剂（5%石 炭酸复红溶液）加温或延长染时间才可着色。 炭酸复红溶液）加温或延长染时间才可着色。但分枝菌 酸与染料结合后，又很难被酸性脱色剂（3%盐酸酒精 盐酸酒精） 酸与染料结合后，又很难被酸性脱色剂（3%盐酸酒精） 脱色，因而被染成红色，故名抗酸染色。 脱色，因而被染成红色，故名抗酸染色。 • 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸 复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。 复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当 再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色， 再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细 非抗酸性菌）及背景中的物质为兰色。 菌（非抗酸性菌）及背景中的物质为兰色。
医学微生物学实验二抗酸染色
抗酸染色法
将革兰氏高阳性细菌中的壁 酸 与背景染色分开，常用于 诊断 结核病和防治控制。
牛乳杆菌株的用途
抗酸染色中采用牛乳杆菌株 作为阳性 细胞壁酸标准菌， 以方便实验检测。
石蜡切片
为保证切片的纵向完整和平 面整齐， 采用质较软而黏稠 的石蜡先切得到小 块，再将 其切成0.3-10微米的块。
样本采集和处理
2. 涂层均匀度较差
可能是涂层次数不够多造成。
4. 样本质量差， 细胞数太小或涂片 太薄
不能达到有效检查的目的。
实验改进及展望
改进措施
我们将加强实验技术指导、提高实验室安全防 护意识，加强实验室管理和规范操作。若实验 过程中发现异常情况，第一时间停止操作并及 时向教师报告。
进一步应用
可以将该方法拓展解放到环保、医药、食品行 业甚至其他应用领域中，为各个领域提供快速、 准确、高效的检测方法。
4. 脱色
加热固定涂片
加热条件
采用显微镜加热载玻片的方法固定涂 片，温度 不宜过高，保持载玻片不会破裂。
加热必要性
涂片制得后，用火炙置于Bunsen燃 气表面，使细菌细胞壁的脂质软化、 附于玻片 上，避免在染色过程中脱 落和变形。
脱色
脱色原理
抗酸染色中用稀硝酸脱除背景色， 使细菌时为红色或粉红色，背景为蓝色。
脱色方法
用70%的乙醇脱色涂片或用1%的酸酒 母进行脱色，然后用自来水将药液冲洗干 净，以去除 剩余的沉淀。
抗酸染色
1
染色需知
抗酸染色必须在导师指导下指导进行，
染色方法
2
操作过程必须严格遵循实验室安全规 范。
将脱色后的涂片置于第一草酸液中5-
10分钟后，绿青色背景逐渐淡化，然
微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程
微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程
1．目的
规范墨汁染色标准操作规程。
2．原理
墨汁染色（负染色法）：背景着色而菌体本身不着色的染色法称负染色法。
此法用以观察细菌及某种真菌的荚膜等。
3．试剂
印度墨汁。
4．质控
新型隐球菌ATCC32609为阳性，白念珠菌ATCC90038为阴性。
5.操作步骤
脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于洁净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。
镜下背景呈黑褐色，菌体无色。
6.结果判断
新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。
7.注意事项
7.1 不要使用过期的印度墨汁。
7.2 墨汁应无污染、无颗粒等。
8.临床意义
主要用于新型隐球菌的鉴定。
参考文献
[1] 周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007
[2] 王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999
（周庭银）
编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员
批准人：。
抗酸染色实验报告书写
抗酸染色实验报告书写抗酸染色实验报告引言：抗酸染色是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在探究细胞组织在不同酸性条件下的染色效果，以及酸性条件对细胞结构的影响。
通过本次实验，我们希望能够深入了解抗酸染色的原理和应用。
实验材料与方法：材料：- 细胞组织样本- 酸性染色剂- 石蜡切片- 显微镜方法：1. 准备细胞组织样本：从动植物组织中取得所需的细胞样本，并进行固定和切片处理。
2. 染色处理：将细胞组织样本分别置于不同酸性条件下，如酸性溶液中或酸性染色剂中，进行染色处理。
3. 洗涤：将染色后的细胞组织样本进行洗涤，以去除多余的染色剂和酸性溶液。
4. 封片：将洗涤后的细胞组织样本置于石蜡中进行封片处理。
5. 显微镜观察：使用显微镜对封片后的细胞组织样本进行观察和分析。
实验结果与讨论：实验结果显示，在不同酸性条件下，细胞组织的染色效果会有所不同。
在酸性溶液中进行染色处理时，细胞组织的颜色较为明亮，染色效果较好。
而在酸性染色剂中进行染色处理时，细胞组织的颜色较为暗淡，染色效果较差。
这一结果可以解释为，酸性溶液中的酸性物质可以更好地与细胞组织中的染色剂发生反应，从而使染色效果更为明亮。
而酸性染色剂可能对细胞组织中的染色剂产生一定的抑制作用，导致染色效果较差。
进一步分析发现，酸性条件对细胞结构也有一定的影响。
在酸性溶液中进行染色处理时，细胞结构相对完整，细胞核和细胞质的边界清晰可见。
而在酸性染色剂中进行染色处理时，细胞结构较为模糊，细胞核和细胞质的边界不够清晰。
这一现象可能是由于酸性条件对细胞膜的影响。
酸性溶液中的酸性物质可以破坏细胞膜，使细胞组织中的染色剂更容易进入细胞内部，从而使染色效果更好。
而酸性染色剂可能对细胞膜产生一定的保护作用，使细胞组织中的染色剂难以进入细胞内部，导致染色效果较差。
结论：通过本次实验，我们深入了解了抗酸染色的原理和应用。
实验结果表明，在酸性溶液中进行染色处理可以获得较好的染色效果，并保持细胞结构的完整性。
医学微生物学实验-抗酸染色 标本片 PPT课件
抗酸染色
材料： 标本：卡介苗 染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝 器具：同革兰氏染色
实验方法：
1、细菌涂片标本的制备
3、油镜观察
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥
油镜观察
美蓝复染1 ’
三、抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
涂片
干燥
固定
2、染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽 即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免 干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30’’~1’；用水冲洗。
3）复染：用碱性美兰溶液复染1’，用水冲洗后用吸 水纸吸干。
医学微生物学实验
实验内容
一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作）
二、标本片观察： （钩体 、白色念珠菌，曲霉、枯草芽胞杆菌、）
目的要求
掌握抗酸染色技术 掌握钩体，白色念珠菌、曲霉、枯草杆
菌基本形态
一、抗酸染色原理
分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸， 它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要 经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的 分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名 抗酸染色。
细菌抗酸染色实验报告
细菌抗酸染色实验报告实验报告：细菌抗酸染色实验引言：细菌抗酸染色实验是一种常用的细菌鉴定方法，通过该方法可以将革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌区分开。
革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在细胞壁结构上存在差异，革兰氏阴性菌的细胞壁较为复杂，含有双层脂质、LPS（内毒素）等成分，而革兰氏阳性菌的细胞壁相对简单，只有一层较为厚实的脂质和Peptidoglycan层。
革兰氏染色方法通过利用胶原褐素（Crystal Violet）、碘溶液（Iodine）、脱色剂（Acetone-alcohol）和洋红素（Safranin）对细菌进行染色，最终根据染色后的细菌在显微镜下的形态、结构等特征来识别细菌。
本实验目的是通过细菌抗酸染色实验来鉴定未知菌株的革兰氏阴性或阳性。
材料与方法：1. 需要的实验材料包括：未知菌株、凝结酸染色试剂盒（含有Crystal Violet、碘溶液、脱色剂和洋红素）、显微镜、草培液、无菌玻璃片、移液管和吸管等。
2. 实验过程：(1) 取一片无菌玻璃片，用吸管将菌落悬于草培液中。
(2) 将菌液滴于玻璃片上。
(3) 用火焰消毒的钳子将玻璃片置于蜡烛火焰上加热，使菌液彻底蒸发。
(4) 取一滴Crystal Violet滴于菌液上，静置1分钟。
(5) 用清水轻轻冲洗至少4次，使菌液完全清除。
(6) 取一滴碘溶液滴于菌液上，静置1分钟。
(7) 用清水轻轻冲洗至少4次，使碘溶液完全清除。
(8) 滴一滴脱色剂滴于菌液上，静置15秒钟，然后用清水冲洗。
(9) 取一滴洋红素液滴于菌液上，静置2分钟。
(10) 最后，用清水冲洗至少4次后，用吸水纸吸干玻璃片上的水分。
(11) 将玻璃片放在显微镜下，逐片观察和分析。
结果与讨论：执行细菌抗酸染色实验后，观察到样品中的细菌在显微镜下呈现不同的颜色和形态，根据这些特征可以初步判断细菌的革兰氏阴性或阳性。
在本次实验中，我们观察到部分细菌样品染色后呈现蓝色，这是由于革兰氏阳性细菌在抗酸染色过程中内外层脂质的覆盖下使Crystal Violet难以穿透细菌细胞壁进入细胞，而碘溶液和洋红素对革兰氏阳性菌的着色没有明显效果；而另一部分样品染色后呈现红色，这是由于革兰氏阴性菌的细胞壁对Crystal Violet有相对较弱的保护作用，但脱色剂的处理下导致Crystal Violet的排除，然后洋红素能够被细菌吸收，从而使细菌呈现出红色。
抗酸染色阴性实验报告
抗酸染色阴性实验报告一、实验目的本实验旨在通过使用抗酸染色技术，观察和分析细菌对抗酸染色剂的反应，进一步了解细菌的形态和结构特征，同时学习使用抗酸染色技术进行细菌的鉴定和分类。
二、实验材料与方法2.1 实验材料- 细菌标本- 抗酸染色试剂：尼氏抗酸染色剂、甲苯精制水、1%石碱溶液2.2 实验方法1. 准备细菌标本，并将其均匀涂布于玻片上。
2. 将涂有细菌的玻片在空气中晾干。
3. 在顺次涂上尼氏抗酸染色剂、甲苯精制水和1%石碱溶液。
4. 轻轻冲洗玻片，使多余的染色剂洗去。
5. 用纸巾轻轻吸去水分，并在显微镜下观察。
三、实验结果与分析观察实验结果，发现细菌在抗酸染色阴性实验中呈现了不同的反应。
一些细菌显示为红色，而另一些则呈现为蓝色，还有一些细菌没有染色。
根据结果，我们可以得出如下结论：1. 红色细菌：这些细菌显示出对尼氏抗酸染色剂的亲和性，并且在观察下可见它们的形状和结构特征。
这些细菌的细胞壁结构不会阻止染色剂的渗透和沉积。
2. 蓝色细菌：这些细菌对抗酸染色剂表现出不同的反应。
这可能是由于这些细菌具有某种抗酸性的特征，导致尼氏抗酸染色剂无法渗透细菌细胞壁。
这可能是由于细菌壁对染色剂具有较高的亲和性，使其不能被抗酸染色剂替代。
3. 未染色细菌：这些细菌未能染色可能是由于其细胞壁的特殊结构，使染色剂无法渗透进去。
这些细菌可能具有特殊的细菌壁层结构或表面性质，使其对尼氏抗酸染色剂无反应。
综上所述，抗酸染色阴性实验是一种较为常用的细菌鉴定和分类技术，通过观察细菌对抗酸染色剂的反应情况，可以初步判断细菌的形态特征和结构特点。
然而，对于某些细菌来说，抗酸染色阴性实验的结果可能不够准确，可能需要进一步结合其他检测技术进行确认。
四、结论本实验通过抗酸染色阴性实验，观察和分析了细菌对抗酸染色剂的反应情况。
根据实验结果，我们可以初步了解细菌的形态特征和结构特点，并对细菌进行鉴定和分类提供一定的参考。
虽然抗酸染色阴性实验在细菌鉴定中具有一定的局限性，但仍然可以作为基础的细菌鉴定技术之一。
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二、墨汁负染色法
步骤
1.滴半滴墨汁于载玻片,取菌并混匀。 2.盖盖玻片(覆盖于菌液上，注意先将盖 玻片一边接触菌液缓缓斜放下，以免产 生气泡)。 3.先以低倍镜找好视野，再换高倍镜观 察。
目 录 末页
二、墨汁负染色法
结果观察
目 录 末页
二、墨汁负染色法
临床意义
新型隐球菌可引起全身各组织器官 炎症，最易侵犯的是中枢神经系统，引 起慢性脑膜炎。
集菌法涂片应按“发现细菌”或“未发现细菌”报告
目 录 末页
二、墨汁负染色法 目的
墨汁负染色法观察新型隐球菌的 形态。
目 录 末页二、墨汁Fra bibliotek染色法原理
新型隐球菌的荚膜较厚，一般不 易着色，同时菌体折光性较强，用墨 汁负染色法可在黑色背景下看到透亮 的菌体。
目 录 末页
二、墨汁负染色法
材料
1.菌种 新型隐球菌 2.试剂 优质墨汁 3.其他 载玻片、盖玻片、镊子、普通 光学显微镜
《医学微生物学》实验五
一、抗酸染色法 二、墨汁负染色法
目 录 末页
一、抗酸染色法 目的
抗酸染色观察结核分枝杆菌的形态。
目 录 末页
一、抗酸染色法
原理
分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量 较高，特别是其中大量分枝菌酸可影响 染料穿入。一旦着色后不易被盐酸酒精 脱色。
目 录 末页
一、抗酸染色法 材料
结核病人的痰液标本、抗酸染色液 试剂盒、试管夹、玻片等。
墨汁负染色法可鉴别新型隐球菌。
目 录 末页
目 录 末页
方法
一、抗酸染色法
1.涂片制备
挑取痰液→在玻片上涂成痰膜(厚膜 片:取标本2-3次)
→干燥→固定。
目 录 末页
方法
一、抗酸染色法
2. 染色 ⑴初染：石炭酸复红染液和加速剂2-3滴
（1min) ⑵脱色：盐酸酒精脱至无色 ⑶复染：碱性美兰 2-3滴（1min) 每一步骤结束后用水冲洗、甩干，复染后干
燥再用油镜观察。
目 录 末页
一、抗酸染色法
结果
结果观察:
抗酸阳性菌为红色 抗酸阴性菌为蓝色
目 录 末页
一、抗酸染色法
结果
报告方式（直接涂片法） 仔细观察300视野(观察时间不少于4min)，未发现抗酸
杆菌。 士：可疑。发现抗酸菌l～2条／300视野。 1+：发现抗酸菌3～9条／100视野。 2+：发现抗酸菌1～9条／10视野。 3+：发现抗酸菌1～9条／每视野。 4+：发现抗酸菌≥10条／每视野。