质粒DNA的双酶切
载体双酶切
载体双酶切技术是分子生物学领域常用的实验技术之一，它通过利用两种不同的限制性内切酶作用于同一个质粒DNA，从而实现对目标DNA片段的精确剪切和克隆。
本文将从载体双酶切技术的原理、应用和优缺点等方面进行详细介绍。
一、原理载体双酶切技术的原理主要基于两种不同的限制性内切酶对DNA的特异性切割。
首先，选择两种能够在同一质粒上切割出相互兼容的黏性末端的内切酶，并确定其最佳反应条件。
然后，将目标DNA片段与质粒进行双酶切反应，使得目标DNA片段的末端与质粒的末端具有互补的黏性末端。
最后，通过DNA连接酶的作用，将目标DNA片段与质粒连接成重组质粒，实现目标DNA片段的克隆插入。
二、应用载体双酶切技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于重组质粒的构建，将外源基因插入到质粒中，用于基因克隆、表达和功能研究。
其次，还可以通过双酶切技术对质粒进行定向修饰，如引入点突变、插入序列或者删除特定片段等，用于研究基因的结构与功能。
此外，载体双酶切技术也被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因组编辑等领域。
三、优缺点1. 优点（1）精准：通过双酶切技术可实现对DNA片段的精确切割和定向连接，保证了重组质粒的稳定性和可靠性。
（2）灵活：可以根据实验需要选择不同的限制性内切酶组合，实现对DNA的多样化操作。
（3）高效：相比传统的单酶切技术，载体双酶切技术能够提高DNA片段的连接效率和克隆成功率。
2. 缺点（1）操作复杂：双酶切技术需要充分考虑两种内切酶的选择、反应条件的优化及连接方法的调整，操作过程较为复杂。
（2）局限性：某些情况下可能无法找到适合的双酶切位点，导致目标DNA片段无法有效插入到质粒中。
（3）成本较高：需要购买多种限制性内切酶和连接酶，增加了实验成本。
综上所述，载体双酶切技术作为一种重要的分子生物学工具，在基因工程和分子生物学研究中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和完善，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力和价值。
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
实验5质粒DNA的双酶切
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五、思考题
Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎 样的末端？
影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
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［注定事项］ 1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，
四、实验步骤
1. 质粒DNA的双酶切
➢ 反应体系：
➢ 反应条件：温度 37℃，酶切1.5h
10×H Buffer 质粒DNA 无菌水 EcoRⅠ XhoⅠ 总体积
2μL
10μL～12μL≤1μg 6μL ～ 4μL 1μL 1μL 20μL（无菌水补至总 体积）
25 °C
37 °C
2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
通过本实验掌握质粒DNA双酶切的 原理和操作方法
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二、实验原理
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限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序
列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个 核苷酸组成的特定序列
寄主控制的限制与修饰现象
多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降 解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序 列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外 源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加， 造成实验失败。
（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。 5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样 电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。
目的基因双酶切
目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。
回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。
注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干。
3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。
双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。
双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。
质粒双酶切构建经验！
质粒双酶切构建经验！大神教你做酶切！1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
bamhi和ecori双酶切原理
bamhi和ecori双酶切原理
双酶切技术是一种分子生物学技术，用于从DNA分子中特异性地剪切出目标DNA片段。
它的原理基于两个限制性内切酶的特异性切割作用，以及DNA的双链结构。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割DNA双链的酶。
不同的限制性内切酶具有不同的切割位点和切割方式。
双酶切技术利用两个限制性内切酶，分别在目标DNA序列的两侧切割，从而将目标DNA片段从DNA分子中剪切出来。
在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。
具体来说，双酶切技术的步骤如下：选择两个限制性内切酶，使它们能够在目标DNA序列的两侧切割，并且它们的切割位点不重叠。
将DNA分子与两个限制性内切酶一起反应，使它们在目标DNA序列的两侧切割。
切割后的DNA分子形成两个断裂端，其中一个断裂端是粘性的，另一个是平滑的。
将DNA分子与质粒或其他DNA分子连接，使粘性断裂端与另一个DNA分子的粘性断裂端连接，形成重组DNA 分子。
将重组DNA分子转化到宿主细胞中，使其复制和表达。
通过双酶切技术，可以将目标DNA片段插入到质粒或其他DNA分子中，用于基因克隆、基因工程、基因组编辑等研究领域。
至于BamHI和EcoRI双酶切原理可以查阅相关书籍或文献了解更多相关信息。
实验一二重组质粒DNA提取双酶切鉴定凝胶电泳紫外分光法
制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；
不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。
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2.4 双酶切体系
合计
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O
37 ℃，1-2h
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
20μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
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思考题？
❖ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？
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三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳
1 原理
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µl TE 溶解DNA
RCF = 1.12r（rpm/1000)2
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
4.室温凝胶30分钟
过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
步骤
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
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• 平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生 平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来
Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在 识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸 对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆
➢ Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割 双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种 限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷 酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9 个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割 可以有两种方式：
• 水浴锅 • 移液枪和枪头 • 制冰机 • 浮板 • R-pGEX-4T-1质粒DNA • XhoⅠ酶 • EcoRⅠ酶 • 10×H Buffer • 无菌水 • 小离心管
四、实验步骤
• 质粒DNA的双酶切 反应体系：
EcoRⅠ XhoⅠ 10×H Buffer 质粒DNA 无菌水 总体积
一、实验目的
• 通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的 原理和操作方法
பைடு நூலகம்
二、实验原理
• 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序 列
• 多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分 子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲 基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识 别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰 现象
• 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互 补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TTC ……3’
3’…… C T T|AA’G …...5’
|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是 回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各 有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合”
• 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
• 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情 况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上 切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类 限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结 构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等
1μL 1μL 2μL 10μL～12μL≤1μg 6μL ～ 4μL 20μL（无菌水补至总体积）
反应条件：温度37℃，酶切1.5h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • 紫外线投射仪观察结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
五、思考题
• Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎 样的末端？
影响限制性内切酶活性的因素：
• DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
双酶切的两种酶介绍
• XhoⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：
• EcoRⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：
三、仪器、材料与试剂
• 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
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