石蜡切片组织DNA抽提
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤注意事项需要自备材料：二甲苯、无水乙醇、异丙醇、磁铁或磁架、1.5mL离心管(最好低吸附的离心管)；需要去除RNA自备RNase A（100mg/ml），在蛋白酶K消化这一步加入4 μl RNase A；◆整个过程请勿离心，以免磁珠不可逆聚集而影响提取效果。
实验准备磁珠用前一定要充分混匀；◆56℃和80℃加热源；◆使用前需在Buffer FTGWI中加入相应体积的无水乙醇，使乙醇比例占80%。
操作步骤1.脱蜡：①切下5 片厚度约为10μM（重约10mg）的组织块，尽量切去石蜡部分，置于1.5ml的离心管中。
加入1ml二甲苯，并振荡30s，然后室温放置5分钟。
20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移尽上清。
②加入1ml 100%乙醇振荡离心管20s，然后20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移去上清，室温干燥组织沉淀15min。
注意：任何残留的乙醇可能会影响蛋白酶K的消化以及减少核酸的得率2. 消化：加300 μL Buffer FTGL，振荡至彻底悬浮，用匀浆机进行匀浆破碎（使其彻底无大块组织残留），再加入20 μL蛋白酶K(PK)，于56℃温浴15min （期间不时混匀），然后置于80℃ 15min；注意：①组织大于50mg时需要增加蛋白酶K (PK)的用量。
3. 裂解结合：将离心管从80℃加热器上离开，冷却至室温，在上清液中加入600 μl Buffer FTGB和600uL 异丙醇，最后加入磁珠悬浮液(MB) 30 μL（使用前充分重悬），颠倒混匀5分钟；将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
4. 漂洗:(1) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW0,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，重复该步骤一次。
(2) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW I,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬,将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
DNA提取操作规程-石蜡切片Omega试剂盒方法
1 目的依据《EZAN.FFPE DNA KIT D3399-01》使用说明书及实际使用情况制定标准操作规程，确保正确、安全操作。
2 适用范围适用于石蜡切片中DNA提取的规范操作。
3 职责实验操作人员负责本程序的进行，实验室负责人负责该程序的监控。
4 标准操作程序4.1实验前准备4.1.1 55-60°C水浴；70°C水浴。
4.1.2. OB蛋白酶加入1.5ml Protease Storage Buffer溶解后，分装保存于-20℃。
4.1.3. DNA Wash Buffer中加入80ml无水乙醇，并于室温保存。
4.2实验操作4.2.1 刮取切片上组织部分的样品至1.5ml离心管，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s 混匀。
4.2.2 10,000×g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)。
4.2.3 加入1ml 无水乙醇涡旋混匀，10,000×g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)。
4.2.4 打开盖子放置15min或直到乙醇挥发。
4.2.5 加入200μL Buffer T1和20μL OB蛋白酶。
4.2.6 55℃水浴3h或至组织消化，每隔20-30min混匀一次。
如果有需要也可消化过夜。
4.2.7 90℃处理60min。
4.2.8 室温静置10-30min，室温10,000×g离心5min去除杂质，小心转移上清至一新1.5ml 离心管中。
4.2.9 加入220ul Buffer BL涡旋混匀。
4.2.10 加入250ul的无水乙醇，高速涡旋15秒混匀。
4.2.11 转移混合液至套有收集管HiBind DNA柱子中，室温下8,000×g离心1 min，弃去滤液。
4.2.12 把柱子装在收集管，加入500ul HB Buffer，室温下8,000×g 离心1min，弃去滤液。
4.2.13 把柱子装在新收集管，加入500ul DNA Wash Buffer，室温8,000×g离心1min。
两种石蜡包埋组织DNA 提取方法的比较
作者简介:张晓萍 (1966-). 女，主管检验师，研究方向为临床免疫检验.
e-mail: liuhui ( o
36
兰州大学学报(医学版)
第 35 卷
平均年龄为 60.8 岁;女性 9 例，平均年龄为 58.0 岁。
检查蜡块组织，剔除有自溶、退变或组织结构不
RNA ，比值低于1. 6 说明含有蛋白质较多 [71 。根据
TES 水浴法提取样品的 D260/ D 280 比值在 1. 6~ 1. 8
之间的样品百分率为 4 1. 2% 。两种结果比较，二甲 苯脱蜡法提取 DNA 的战度和纯度明显优于改良
TES 水浴法，结果见表 1 、 20
表 1 样品吸光度测定值及比值
改良 TES 水浴法
min , 15000 r/min 离心 15 min ，弃上清，重复 2 次。
4 1. 2% in DNA samples extracted by improved TES water-bath , and the strips were obscure.
Conclusion The xylene dewaxing DNA extraction method is simpler , quicker , more effective ,
为 62.5% ，电泳条带清晰可见;改良 TES 水浴法提取样品 D260/ D 280 比值在 1.6~1. 8 之间的为 4 1. 2% ，电
泳条带模糊不清。结论二甲苯脱蜡法提取 DNA 简单快速，需要的组织样品少，是一个值得推荐的石蜡
包埋组织 DNA 的提取方法。 关键词:石蜡包埋组织
中图分类号: R361
{1. Clinical
Lαbomtory，
从石蜡组织中提取DNA
石蜡包埋组织DNA提取方法
一脱蜡：
1、切取石蜡组织5-10片（5um—7um）放入1.5ml的离心管中；
2、加入1ml二甲苯，55°10min，离心轻弃上清，重复两到三次（因组织而定）；
3、加入1ml无水乙醇，室温三分钟，重复二次，离心弃上清，并干燥待酒精挥发。
二消化：
例：设置250ul体系，加入2x裂解液125ul、10%SDS 5ul、蛋白酶k25ul（1mg /ml）、纯水95ul（以上根据裂解液、SDS、蛋白酶K的配置浓度不同和组织量多少而需重新设置），55°消化过夜（按组织的消化情况而定，若没消化完全可适量加入蛋白酶k），直至组织完全液化。
三抽提：
1、加纯水至500ul，加入Tris饱和酚250ul，颠倒混匀，静置5min，再加入250ul 氯仿，颠倒混匀静置5min ，瞬时离心，
2、取出上清液至1.5ml离心管中，加入500ul氯仿，轻混匀，室温静置5min瞬时离心；取上清400ul（吸取液体量可比总体积小，避免吸到蛋白）
四沉淀DNA ：
1、加入3M醋酸钠40ul（醋酸钠的量是吸取上清体积的十分之一），轻混匀，加入880ul无水乙醇（两倍体积）混匀，-20°过夜。
五收集DNA
1、13000rpm 15min，离心轻弃上清
2、加入75% 1ml酒精轻洗，即刻13000rpm 5min 轻弃上清，空气干燥（可用55℃），待干燥为止。
六加入50-100ul纯水溶解，30分-1小时。
石蜡包埋组织的DNA提取
石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对开矿学延伸。
通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
石蜡切片提取基因组操作标准
规范从石蜡切片提取基因组操作标准目的：规范提取石蜡切片基因组操作设备和材料：试剂：FFPE Tissue Genomic DNA Kit仪器：离心机，水浴锅，核算测试仪，漩涡振荡器样品处理：1、石蜡切片样品：将水浴锅打开并调至90度， 55度各一个。
注意：Hp检测不适应10um厚度样本，需要提供6um厚度样本1.1 有条件的实验室，将样品分装成两份，一份留作备用，另一份将样品编号。
1.2 将5-10片切片组织加入250ul Buffer GA， 90度孵育30min-60min。
（若Buffer GA 出现沉淀，在温水中溶解后再使用。
）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的时间和温度过长过高都会造成DNA的断裂。
1.3 90度孵育后，12000rpm 离心2Min，小心穿过石蜡层，吸取200ul 包含组织的液体到一新的1.5mlEP管中，加入20ul 蛋白酶k ，颠倒混匀。
（加入蛋白酶的量可依据组织的多少而定，若过夜笑话组织仍未消化完全，需要考虑蛋白酶k 自身问题）1.4 55度水域，过夜消化，以组织基本都消化为准。
DNA提取：将水浴锅打开并调至70度，并将Elution Buffer 70度预热。
1、将消化后的样品12000rpm 离心2min，吸取上清到一新的编好号的EP管中，加入250ul Buffer GB，充分震荡混匀，70度10min。
2、加入250ul 无水乙醇，充分震荡混匀。
3、转移混合液到编好号的DNA吸附柱中（口腔拭子用枪头挤压吸取混合液），放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液。
4、加入500ul Buffer GD，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
5、计入500ul Buffer PW，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
6、重复步骤5.7、吸附柱套到新的收集管中，12000rpm离心2min。
石蜡标本DNA提取
石蜡标本DNA提取第一天：1.脱蜡①加入二甲苯1.2-1.3ml，震荡混匀，70℃，10min孵育，13000rpm离心2min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
2.脱二甲苯：①加酒精即无水乙醇1.2-1.3ml，震荡混匀（剧烈），13000rpm离心1.5min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
3.开盖，70℃，静置30min，直至管中无水乙醇挥发完全。
4.加入180ul ATL Buffer，20ul蛋白水解酶混匀，放入56℃水浴锅孵育过夜。
第二天：1.观察组织消化程度，若组织消化不完全，加适量蛋白水解酶（5-10ul），56℃孵育0.5-1.0h。
2.90℃金属浴1h。
3.待温度冷却至室温，加入200ul AL Buffer，轻轻混匀后，迅速加入200ul无水乙醇，上下颠倒混匀。
4.13000rpm离心10-20s，将上清移至吸附柱内，勿吸入白色沉淀。
5.13000rpm离心1min，至离心柱内液体全部离心至收集管中。
6.弃收集管，将吸附柱放于新的收集管中，加入AW1 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
7.弃去收集管中液体，加入AW2 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
8.弃收集管，将吸附柱放于另一个新的收集管中，13000rpm离心3min。
9.弃收集管，将吸附柱放于干净的1.5ml EP管中，开盖，70℃，金属浴放置20-30min，至酒精挥发完全。
10.离心柱中央加入50-100ul ATE Buffer（70℃预热），置70℃5-10min。
11.13000rpm离心1.5min。
12.将DNA保存于-20℃。
从石蜡包埋组织中提取DNA
基因突变检测实验操作流程一、DNA提取1.Extract RNA（详见QIAGEN Rneasy FFPE Kit,货号74404）注意：所有的离心步骤均在室温下进行。
1)用刀片切除多余石蜡，暴露组织。
2)切片厚度为5-10um（若样本表面已暴露于空气中，则弃掉刚开始的2-3片）。
3)迅速将样本切片放入1.5或2.0ml的小离心管中，加入1ml的二甲苯，盖上管盖，旋涡样剧烈振荡10s。
4)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
5)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
6)加入1ml乙醇（96-100%），旋涡样充分混匀。
7)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
8)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
9)打开管盖，在室温或37℃下放置10min，直至残留乙醇挥发完。
10)加入180ul缓冲液ATL重悬沉淀，再加入20ul蛋白酶K，充分混匀。
11)于56℃孵育1h（直至样品完全溶解）。
12)90℃孵育1h。
13)稍稍点动离心去除管壁上的液体。
14)加入200ul Buffer AL 于样品中，充分混匀，再加入200ul乙醇（96-100%），再次充分混匀。
15)稍稍离心去除管壁上的液体。
16)将所有的液体混合物转移至QIAamp吸附柱内（套在2ml的收集管内），垂直加入，不要湿润管壁，盖上管盖，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
17)小心打开QIAamp吸附柱，垂直悬空正中加入500ul Buffer AW1，不要加到管壁上。
盖上盖子，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp 吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
18)加入500ul Buffer AW2于QIAamp吸附柱内，8000rpm离心1min，弃掉收集管和管内液体，并将QIAamp吸附柱置于一个干净的2ml收集管中。
19)14,000rpm离心3min。
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实验部分：安全注意事项
实验室内必须戴专用安全眼镜 实验室内必须穿实验服 办公区内不准穿实验服 实验室内动手做实验前必须戴手套
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实验部分：分组
组 姓名 岳麓 邢士超 张稷 #1 陈建 韩晓红 王帅 #2 吴传勇 李喆 冯芬 #3 时利 组 姓名 刘毅 王高文 #4 李建民 王玉艳 谭小军 张晔 #5 李喆 蔡旭
石蜡组织切片DNA抽提
鹿亚超/ Peter Lu
阿斯利康中国创新研究中心 (ICC) 2010.04.11
ANNUAL BUSINESS REVIEW
概览
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
样品处理
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
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内容
1. EGFR 突变检测申请 2. 样品处理 3. DNA抽提
-5-
DNA抽提前
福尔马林固定石蜡包 埋组织(FF-PET)
病理学评估 确认肿瘤细胞 数大于50
-6-
3. DNA 抽提
福尔马林固定石蜡包埋组织
受破坏DNA（固定步骤）
降低DNA 得率
后续分析困难
需要可靠的DNA抽提方法
-7-
DNA抽提方法
• 商业试剂盒 vs. 实验室固有方法
试剂盒 质控情况 方便性 成本 DNA质量 经过质控 方便 高 取决于方法 实验室固有方法 可能有内部质控 不方便 低
• 一般，DNA质量越高的方法，DNA得率越低。 • 需要样品量：4~5cm25µm
-8-
Qiagen QIAamp DNA Mini Kit
订购方便 已质控试剂盒 DNA得率相对较高
-9-
QIAamp Mini Kit Procedure
- 10 -
石蜡组织切片DNA提取：实验原理
2.组织切片刮取
3.加热裂解消化DNA
4.去除石蜡
通过离心石蜡将悬浮于裂解液上层，吸取 石蜡层下的溶液，注意吸取时应尽量小心
以避免吸入石蜡等污染物
5.吸附柱收集DNA
使用QIAgen吸附柱收集
- 12 -
该方法优点
无需二甲苯脱蜡，避免对实验人员的伤害 采用加热与吐温蛋白酶K结合，充分裂解胞核消化DNA 采用QIAgen吸附柱有效快速收集DNA，减少PCR抑制剂影响
- 11 -
石蜡组织切片DNA提取步骤
1.石蜡组织切片收集 及鉴定
每个样本以约4~5cm25µm的石蜡组织切 片量为宜，每张片子应由病理医生进行 病理鉴定，并圈出肿瘤区域 使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡 组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞 散造成交叉污染 通过吐温20释放使DNA从细胞核中释放， 蛋白酶K消化组蛋白,消化裂解过夜，期 间至少重复加入4µL 10mg/mL蛋白酶K两 次，每次间隔1小时以上
加热法&QIAgen DNA试剂盒： 通过高温结合吐温20以及蛋白酶K使DNA从石蜡组织中裂解 释放，并通过DNA吸附柱有效提取DNA 关键点：
吐温20：非离子型变构剂, 裂解细胞核释放DNA 蛋白酶K：消化与DNA结合的组蛋白
DNA吸附柱：有效快速收集DNA，有效减少PCR反应抑制剂对后续实 验的影响
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控制交叉污染
必须严样品用一个解剖刀片
实验前后清洁工作区 经常换手套
无PCR产物区域
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核心信息
可靠的样品追踪记录 DNA质量不高 （FFPET样品） 可靠的DNA抽提方法方便后续
EGFR突变分析
控制样品间交叉污染
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样品处理
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
-3-
1. EGFR 突变检测申请
-4-
样品处理
组织蜡块
切片
病理学评估
DNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间）
LIMS (实验室信息管理系统) Microsoft Excel or Access 手写记录