尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究
多糖提取 物对 Ａ Ｔ Ｂ Ｓ自由基 的抑制 率为 ７ ．３ ；０ｍｇ （ ｇ・ ） ７ ４ ％ ５ ／ ｋ ｄ 的尖顶 羊肚菌胞外 多糖提 取物 能使 雄性 、 性小 鼠 雌
脑 Ｓ Ｄ活性分别提高 ２． ０ 、１１ ％ ， Ｆ含 量分 别降低 ３ ．４ 、６ ９ ％ ， Ａ含量分别减少 １．０ 、５ ６ ％ ． Ｏ ０７ ％ ２． ３ Ｌ ５ １ ％ ４ ．３ ＭＤ ５ １％ １． １ 表明尖顶羊肚 菌胞 外多糖提取物具有 良好 的抗氧化和延缓衰老作用 ， 对雌性小 鼠效果略优于对雄性小 鼠．
｝通讯作者 ，ｈｎｓ ｃｌ ｅｕ ｃ ｚａ ｇ＠８ｎ ．ｔ ．ｎ １ ｌ
第 ２期
潘志福等 ： 尖顶羊肚茵胞外 多糖提取物抗 氧化作 用的研 究
１５ ２
１ ２ ４ 多糖 提 取 物 对 Ａ Ｔ 自由基 抑 制 作 用 按 ． ． ＢＳ
照文献 ［ — ］ ７ ８ 的方法并稍加改进 ， 测定多糖提取物
离子 自由基 的抑 制 率 ， 测定 的具 体 方法 参 照抗 超 氧 阴离 子试剂 盒说 明书．
（０± ） 由中山医科大学动物实验 中心提供 ， ２ ２ｇ 饲养 环境温度 ２ ２ ４～ ６℃ ， 可证号 ：Ｃ Ｋ（ ２０ 许 Ｓ Ｘ 粤） ０４—
０ ０】 ． １
１２ ３ 多糖提取物对羟基 自由基的抑制作 用 参 ．． 照柳红 的方法 ， 利用邻二 氮菲 一金 属铁离子 一 Ｈ Ｏ 体系测定提取物对羟基 自由基的抑制率． ：：
文章编 号 ： ０ ０— ４ ３ ２ １ ） ２— １４— ５ １０ ５６ （ ０ １ ０ ０ ２ ０
尖 顶 羊肚 菌胞 外 多糖 提 取 物 抗 氧化 作 用 的研 究
潘 志福 ，兰 瑛 ，张 。 松
（． １华南师范大学生命科学 学院， 广东广州 ５ ０ ３ ； ． １６ １ ２ 深圳市 国想生物科技有限公 司， 广东深圳 ５ ８ １ ） １１４
淀， 将沉淀物真空冷冻干燥 ， 获得尖顶羊肚菌胞外多 糖 提取 物 （ 称 多糖 提取 物 ， 同 ） 简 下 ．其 主 要 成分
为 ： 糖含量 ５ ． ０ ； 白质含量 ７ ８ ％ ． 总 ９４ ％ 蛋 ．８ １２ ２ 多糖提 取 物 对 超氧 阴 离子 自由基 的抑 制 作 ．．
１ 材 料 与方 法
为 ７ ． ３ ． 明多糖 提取 物对 Ａ Ｔ ７４ ％ 说 Ｂ Ｓ自由基有 较强
的抑制 能力 ．
鎏３ ４ ０
晕 ２ ０
ｌ ０ Ｏ
碍
器 晕
图 １ 尖顶 羊肚菌胞 外多糖提 取物对 超 氧阴离 子 自由基 的
抑制作用
Ｆ ｇ ｒ Ｉ ｈ ｂ ｔ ｎ ｏ ｈ ｘ ｐ ｌ ｓ ｃ ｈ ｒ ｅ ｅ ｔ ｃ ｒ ｍ ｉｕｅ １ ｎ ｉ ｉ ｏ ｆｔ ｅ ｅ ｏ ｏ ｙ ａ ｃ ａ ｉ ｘｒ ｔｆｏ Ｍ． ｉ ｄ ａ
天， 实验结束后 ， 断颈法取脑 ， 在超声波细胞粉碎仪 制成大脑匀浆 ， 离心后 ， 取上 清液 ， 用黄嘌呤氧化酶
法测 定 小 鼠 的 Ｓ Ｄ 活 性 ， 代 巴 比 妥 酸 法 测 定 Ｏ 硫
Ｍ Ａ含量 ， Ｄ 荧光 比色法测定 Ｌ 含量 ， Ｆ 测定的具体方
法均 参 照试剂 盒 说 明 书．数 据采 用 Ｄ Ｓ３０ Ｐ ． １软 件 进行 统 计 ， 用 Ｌ Ｄ（ｅｓ ｓ ｎｆ ａｔｄｆｒｎｅ 法 采 Ｓ １ａｔ ｉ ｉｃｎ ｉｅｅｃ ） ｇｉ ｆ （ 小显 著性 差异 法 ） 最 进行 方差 分析 ． １２６ 肝 脏切 片组 织的观 察 ．． 取 出小 鼠肝脏 ， 积 体 分数 １％ 的福尔 马林 溶液 保 存 ， 常 规石 蜡 切 片 制 ０ 按 作方 法 ， 梯度 乙醇脱 水 处 理 、 石蜡 包 埋 、 甲苯脱 蜡 ， 二 伊红 一苏木素染 色 ， 在光学显微 镜下 观察肝 脏切 片 的
注射等量 的生理盐水 ， 连续注射 ４ ２天． 、 高剂 低 中、 量组分别灌 胃尖顶羊肚菌多糖提取物为 ５ 、 ０ ８０ ０２ 、 ０ ０ ｍ ／ｋ ｄ ， ｓ （ｇ・ ） 阳性对照组灌 胃量为 ８０ｍ ／ ｋ ｄ ０ ｓ （ｇ・ ）
的维生 素 Ｅ， 白对 照组 和造 模 组 分 别 灌 胃生 理 盐 空 水 ， 组 小 鼠 的 灌 胃量 均 为 ０ ２ｍ 连 续 灌 胃 ４ 各 ． Ｌ， ２
关键词 ： 尖顶羊肚菌 ； 外多糖 ；抗氧化 胞
中图分类 号 ：６ ６ ￥４ 文献标 志码 ： Ａ
尖 顶羊 肚菌 是 一种 珍 稀 的食 药用 真 菌 ， 究 发 研 现 ， 有 抗 氧化 、 肿 瘤 、 它 抗 免疫 调 节 、 疲 劳 、 血脂 抗 降
１ １ ３ 主要 试剂 ２ ２联 氮 一二 （ ．． ， ３一乙基 一苯 并
对ＡＴ Ｂ Ｓ自由基 的抑制 率 ． １２ ５ 小鼠 生理 生 化 实验 ．． 将 小 鼠随 机 分 为 空 白 对 照组 、 模组 、 造 阳性对 照组 、 多糖 提 取物低 剂 量组 、 中剂量 组 、 剂 量 组 共 ６个 组 ， 组 １ 只 ， 雄 各 高 每 ０ 雌 半， 自由进 食 和 饮 水 ， 模 组 、 造 阳性 对 照 组 、 剂 量 低 组、 中剂量 组 、 剂 量 组 每 天 腹 腔 注 射 剂 量 为 １０ 高 ２ ｍｓ （ｇ・ ） Ｄ一半 乳糖溶 液 ０ ２ｍ 空 白对 照组 ／ｋ ｄ的 ． Ｌ，
收稿 日期 ： ００— ９—１ ２１ ０ ９
基金项 目： 广州 市科技计划项 目（ ０ ７ ３ Ｅ ４ １ ； ２０ ７ 一 ０２ ）广东省部产学研结 合项 目（ ０ ９ ０ ０ ０ ２８ ； ． ２ ０ Ｂ ９ ３０ ９ ） 华南师 范大学 国家大学生创新 性实验计 划
项 目 （９０ ７ ２ ） ０ １ ５４ ５ ．
噻唑 一 ６一磺酸） 二铵盐 （ Ｂ Ｓ 、 Ａ Ｔ ） 抗超氧 阴离子试
剂盒 、Ｏ Ｓ Ｄ试 剂 盒 、 Ｄ Ｍ Ａ试 剂 盒 、Ｆ试 剂 盒 均 购 自 Ｌ 南京 建成生 物 工 程 研 究 所 ； Ｄ一半 乳 糖 购 自上 海 伯 奥生 物科技 有 限公 司 ； 生 素 Ｅ购 自广州 星群 （ 维 药
２ 结 果 与 分 析
２ １ 多糖提取 物对 超 氧 阴离子 自由基 的抑 制作用 ． 多糖 对超 氧 阴离子 自由基 的清 除能力 以抑制 率 表示 ， 制 率越 高 ， 明多 糖抗 氧 化作 用 越 强 ． １ 抑 说 图
６ ０ ５ ０
Ａ Ｔ 自 由基 的 抑 制 能 力 逐 渐 加 强 ， 抑 制 率 为 ＢＳ 当 ５ ％时 ， 别对 应 的 多糖 提 取 物 质 量 浓 度 为 ０ ０６ ０ 分 ．２ ｍｇｍ 、 ｃ质 量 浓 度 为 ００７ｍｇｍ ． ／ ＬＶ ．２ ／ Ｌ 当质 量 浓 度 为 ０ １ｍ ／ Ｌ时 ， 取 物对 Ａ Ｔ ． ｇ ｍ 提 Ｂ Ｓ自由基 的抑 制 率
可见 ， 低质量浓度 时， 维生素 ｃ Ｖ ） （ ｃ 对超氧 阴离子 自由基的抑制率较高 ， 随质量浓度的增大 ， 多糖提取 物和 Ｖ ｃ二 者 对 超 氧 阴离 子 自由基 抑 制 效 果 接 近 ． 达 到 ２ｍｇｍ ／ Ｌ时 ， 多糖 提取物 的抑 制率 为 ４ ．６ ， ３０ ％ 这表 明多糖提 取 物对超 氧 阴离子 自由基具有 一 定 的 抑制 作用 ， 抑制 效 率 与 多糖 提 取 物 质量 浓度 呈 正 且 相关 ． ２ ２ 多糖提取 物对 羟基 自 由基 的抑 制作用 ．
业 ） 份公 司． 股
１２ 方法 ．
及抗菌等作用 ， 具有重要的开发和利用价值¨ ４． Ｉ 多
糖是 其 主要 的活性 物 质 ， 而 关 于尖 顶 羊 肚 菌胞 外 然 多糖 提取 物抗 氧化 和 延 缓 衰 老 的研 究 尚不 多见 ． 本 研究 通过 液 体 培 养 获 得 尖 顶 羊 肚 菌 胞 外 多 糖 提 取
组织形 态．
作用
Ｆ ｇ ｒ Ｉ ｈ ｂｔ ｎ ｏ ｈ ｘ ｐ ｌｓ ｃ ｈ ｒｄ ｘｒ ｃ ｒ ｍ ｉｕ ｅ ２ ｎ ｉ ｉ ｏ ｆ ｔ ｅ ｅ ｏ ｏｙ ａ ｃ ａ ｉ ｅ ｅ ｔ ｔｆｏ Ｍ． ｉ ａ ｃ ｎｃ ｎ ｈ ｄ ｏ ｙ ａ ｉａ ｏ ｉａ ｏ ｙ ｒ ｘ ｌｒｄ ｃ ｌ
图 ２显 示 ， 多糖提 取 物和 Ｖ ｃ均具 有抑制 羟基 自 由基 的 能力 ， 它们 的 抑制 能 力 均 与 其 质量 浓 度 呈 正 相关 ． 制率 为 ５ ％对 应 的提取 物质 量浓 度 为 ０ ８ 抑 ０ ．１ ｍ／ ； ｇｍＬ 当质 量 浓 度 为 １ｍｇｍ ／ Ｌ时 ， 取 物 对 羟 基 提 自由基 的抑制 率为 ７． ％ ． 表 明多 糖 提 取物 对 羟 ２４ 这 基 自由基 具有 一定 的抑 制能 力．
样 品质 量 浓 度 ／ ・ （ ｍＬ ） ｍｇ
图 ２ 尖 顶 羊 肚 菌胞 外 多 糖提 取 物 对 羟 基 自由基 的抑 制
２ ３ 多糖提 取 物对 Ａ Ｔ ． Ｂ Ｓ自由基 的抑制 作用 图 ３显示 多 糖提 取物 对 Ａ Ｔ Ｂ Ｓ自由基 具 有 较好
的抑制 作用 ， 着 多 糖 提 取 物 质 量 浓 度 的 增 加 ， 随 对
１ １ 材 料 ．
用 模 拟机 体 中黄 嘌 呤 与黄 嘌 呤 氧化 酶 反 应 系统 ，
尖 顶羊 肚 菌 （ ｒｈｌ ｏ ｉ ） Ｍｏｃｅａｃｎｃ ， ｌ ａ 产生超 氧 阴离子 自由基 ， 定 多糖 提 取 物对 超 氧 阴 测
１ １ １ 供 试 菌种 ．．
由华南 师 范大学 生命 科学 学 院提供 ． １ １２ 实验 动 物 昆 明 种 小 鼠，Ｐ ． ． Ｓ Ｆ级 ， 质 量 体
物 ， 测 其对 超 氧 阴离 子 自由基 、 检 羟基 自由基及 ＡＴ Ｂ Ｓ自由基的抑制作用 ， 究其体外抗氧化活性 ， 研 并将尖顶羊肚菌胞外 多糖 提取物灌 胃衰 老模 型小 鼠， 观察其对小 鼠超氧化物歧 化酶 （ Ｏ ） 脂褐素 ＳＤ 、 （Ｆ 、 Ｌ ）丙二醛 （ Ｄ ） 的影 响来研究其抗 氧化作 Ｍ Ａ等 用， 为认 识其作 用机制 和开 发健康 食 品提供 实验
真菌多糖抗氧化活性的研究进展
（ ｐ．ｏ ａｒ ｎ ｉ． ａ ｔ ｉｈ ｄ ｓ ｏａ’ ｅｈ ｏ１． ａ ｔ １０ ５ Ｄｅｔ ｆＤ ｉ Ｅ ｇｎ 。Ｂ ｏ ｕＬｇ ｔｎ ｕｔ ｃｔｊ ｅ．Ｃｌ ８ ｏｏ ０ ４ ３ ） ｙ ｏ ｌ ．Ｖ Ｔ ． ｕ
Ａ ｓ ａ ｔ Ｆ ｎ ａ ｐ ｌ ａｃ ａｉ ｓ（ Ｐ ｒ ｒｓｎｌ ｂ ｃ ｍ ｎ ｎ ｆ ｈ ｓａ ｈｈ ｔ ｐ ｔ ａ ｏ ｇｎ ｍ ｒｕ ｃ ｎ ｂｔ ｃ ｒ ｕ ｇｌ ｏ ｓ ｃｈ ｒ ｅ Ｆ ）ａｅｐｅｅ ｔ ｅ ｏ ｉｇｏ ｅｏ ｅｒ ｅ ｃ ｏ ｓ ｏ ｍ ｎ ｕ ｅｏ ｓ ｉ － ｙ ｄ ｙ ｔ ｅ ｒ ｓ ｓｅ
糖一 般称作 胞外 多糖 ， 因此 ， 菌 多糖 可 以初 步划 真 分为子 实体 多糖 、 菌丝体 多糖和胞 外 多 糖 ３大 类 。
同一真 菌 的这 ３种 多糖 的 抗氧化 活 性 大小 一般 存 在差异 “ ， 文对 这 ３类 多糖 的抗 氧化 活 性 研 】本 究 进展 进行 了简 要概 述 。
力， 以及 对二 价铁离 子 的螯合 能力 和还 原力 ， 结果 证 实这 ３种 多糖均 有较 强的体 外抗 氧化 活性 。胡 晓倩 等 ¨ 对 热 水 浸 提 的 茶 树菇 多糖 的 体外 抗 氧 化 活性进 行 了研 究 ， 现 茶树 菇 多 糖 具 有 良好 的 发 抗 氧化性 能 ： 在试验 浓度 范 围 内 ， 总还 原 能力 和 其
收 稿 日期 ：０ ２０ －８； 回 日期 ：０ ２ １１ ２ １ －１ 修 ０ ２ １－ － ０ ０
８ ４
微
生
物 ． 学
杂
志
１ 子 实体 多糖 的 抗 氧 化 活 性研 究
现状
由于真 菌 子 实 体 的采 集 和 后 续 处 理 比较 方
羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ｊｕｌ.２０１９ꎬ３９(７):８８７－８９５ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１８１１０３８引文格式:周益帆ꎬ杨滢ꎬ卢会敏ꎬ等.羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究[Ｊ].广西植物ꎬ２０１９ꎬ３９(７):８８７－８９５.ＺＨＯＵＹＦꎬＹＡＮＧＹꎬＬＵＨＭꎬｅｔａｌ.ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａａｎｄｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０１９ꎬ３９(７):８８７－８９５.羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究周益帆１ꎬ杨㊀滢１ꎬ卢会敏１ꎬ王㊀静２ꎬ刘松青１ꎬ王㊀芳１∗(１.成都师范学院化学与生命科学学院ꎬ成都６１１１３０ꎻ２.乌海节能监察监测中心ꎬ乌海０１６０００ꎬ内蒙古)摘㊀要:为了探讨碱法提取羊肚菌多糖的工艺条件并测定其抗氧化活性ꎬ该研究以四川北川羊肚菌为原料ꎬ采用碱法提取羊肚菌多糖ꎬ利用苯酚－硫酸法对羊肚菌多糖得率进行测定ꎬ并通过单因素探讨提取温度(７０㊁８０㊁９０㊁１００ħ)㊁提取时间(２㊁４㊁６㊁８ｈ)㊁碱液浓度(０.４㊁０.６㊁０.８㊁１.０ｍｏｌ Ｌ￣１)㊁料液比(１ʒ１５㊁１ʒ２０㊁１ʒ２５㊁１ʒ３０ｇ ｍＬ￣１)对羊肚菌多糖得率的影响ꎬ同时采用正交试验优化提取工艺ꎬ对其抗氧化活性进行测定ꎮ结果表明:在提取温度９０ħ㊁提取时间５ｈ㊁碱液浓度０.７ｍｏｌ Ｌ￣１㊁料液比１ʒ２０(ｇ ｍＬ￣１)条件下得到的羊肚菌多糖得率为５.３９％ꎮ羊肚菌多糖具有较强的清除ＤＰＰＨ自由基㊁羟自由基㊁超氧阴离子的能力和较好的还原能力ꎬ其ＩＣ５０分别为０.４６８㊁０.２０８㊁０.０２２㊁０.０１４ｍｇ ｍＬ￣１ꎬ抗氧化能力依次为还原能力>超氧阴离子清除能力>羟自由基清除能力>ＤＰＰＨ自由基清除能力ꎮ优化后的羊肚菌多糖提取工艺合理㊁可行ꎬ且羊肚菌多糖具有较强的抗氧化活性ꎮ关键词:羊肚菌ꎬ多糖ꎬ碱提法ꎬ工艺优化ꎬ抗氧化活性中图分类号:Ｑ９４６㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０１９)０７￣０８８７￣０９ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａａｎｄｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙＺＨＯＵＹｉｆａｎ１ꎬＹＡＮＧＹｉｎｇ１ꎬＬＵＨｕｉｍｉｎ１ꎬＷＡＮＧＪｉｎｇ２ꎬＬＩＵＳｏｎｇｑｉｎｇ１ꎬＷＡＮＧＦａｎｇ１∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅꎬＣｈｅｎｇｄｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１１１３０ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＷｕｈａｉＥｎｅｒｇｙＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＣｅｎｔｅｒꎬＷｕｈａｉ０１６０００ꎬＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｅａｌｋａｌｉｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ.ＭｏｒｃｈｅｌｌａｉｎＢｅｉｃｈｕａｎＣｏｕｎｔｙｏｆＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｒａｗｍａｔｅｒｉａｌꎬａｄｏｐｔｉｎｇａｌｋａｌｉｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅꎬａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｐｈｅｎｏｌ￣ｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬ收稿日期:２０１９－０１－１６基金项目:国家自然科学基金(３１８７０３０９)ꎻ四川省科技厅科技扶贫项目(２０１６ＮＦＰ００９１)ꎻ川菜发展研究中心科研项目(２０１６ＣＣ１６Ｚ０６)ꎻ大学生创新创业项目(１０７２６０１１５ꎬ１０７２６０４７１)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１８７０３０９)ꎻＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｏｖｅｒｔｙＡｌｌｅｖｉａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍｏｆＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(２０１６ＮＦＰ００９１)ꎻＳｉｃｈｕａｎＣｕｉｓｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒａｍ(２０１６ＣＣ１６Ｚ０６)ꎻＣｏｌｌｅｇｅＳｔｕｄｅｎｔｓＩｎｎｏｖａ￣ｔｉｏｎａｎｄＥｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐＰｒｏｇｒａｍ(１０７２６０１１５ꎬ１０７２６０４７１)]ꎮ作者简介:周益帆(１９９６－)ꎬ女ꎬ四川巴中人ꎬ研究方向为食品营养与微生物资源ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２２９５８３９９８４＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ∗通信作者:王芳ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ研究方向为食品营养与微生物资源ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｆａｎｇｂｉａ＠１６３.ｃｏｍꎮｗｈｉｃｈｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ(７０ꎬ８０ꎬ９０ꎬ１００ħ)ꎬｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ(２ꎬ４ꎬ６ꎬ８ｈ)ꎬａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ(０.４ꎬ０.６ꎬ０.８ꎬ０.６ｍｏｌ Ｌ￣１)ꎬｓｏｌｉｄ￣ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ(１ʒ１５ꎬ１ʒ２０ꎬ１ꎬ２５ʒ３０ｇ ｍＬ￣１).Ｔｈｏｓｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｅｒｅａｌｓｏａｓｓａｙｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ９０ħꎬｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ５ｈꎬｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０.７ｍｏｌ Ｌ￣１ａｎｄｓｏｌｉｄ￣ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ１ʒ２０ｇ ｍＬ￣１ꎬｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗａｓ５.３９％.ＴｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＭｏｒｃｈｅｌｌａｈａｄａｐｏｗｅｒｆｕｌｓｃａｖｅｎｇｅＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓꎬｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌｓꎬｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｓꎬａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｇｏｏｄｒｅｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙꎬｗｈｏｓｅＩＣ５０ｗｅｒｅ０.４６８ꎬ０.２０８ꎬ０.０２２ꎬ０.０１４ｍｇ ｍＬ￣１ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＭｏｒｃｈｅｌｌａａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙｗａｓａｒｒａｎｇｅｄｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ>ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎ>ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ>ＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｅｘ￣ｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａｗａｓｒｅａｓｏｎａｂｌｅꎬｆｅａｓｉｂｌｅａｎｄｈａｄｓｔｒｏｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｍｏｒｃｈｅｌｌａꎬｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅꎬａｌｋａｌｉｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄꎬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ㊀㊀羊肚菌是珍稀的野生食(药)用菌之一ꎬ属于真菌界子囊菌门子囊菌纲盘菌目羊肚菌科羊肚菌属ꎬ因其形似羊肚而得名(赵琪等ꎬ２０１０)ꎮ经研究发现ꎬ羊肚菌多糖具有抗疲劳(Ｇｕｏꎬ２０１５)㊁抗肿瘤(陈彦等ꎬ２００８)㊁抗氧化(Ｚｉｅｔａｌ.ꎬ２０１８)等作用ꎬ且在一定程度上能够减轻癌症患者放疗㊁化疗引起的毒副作用(李娟等ꎬ２００５)ꎮ因此ꎬ羊肚菌在医学界和保健食品界倍受关注ꎮ已报道的羊肚菌多糖提取方法主要有酶提取法(Ｚｈａｏｅｔａｌ.ꎬ２０１８)㊁水提醇沉法(刘浪浪等ꎬ２００９)㊁微波－超声提取法(黄生全等ꎬ２０１０)等ꎬ以上提取方法均以破坏细胞壁为前提ꎬ促使多糖的溶出ꎮ但是ꎬ羊肚菌多糖存在于细胞壁中的小纤维网状结构基质内(李蔚ꎬ２００８)ꎬ大多与其蛋白质结合在一起ꎬ测量其多糖得率时需要掩蔽蛋白质的影响ꎬ使整个提取工艺流程变得复杂㊁费时ꎮ任嘉兴等(２０１８)㊁毕博和于荣利(２０１６)研究表明ꎬ水提醇沉法提取羊肚菌多糖的得率分别为４.２４％㊁２.２５％ꎮ吉仙枝和陈玮(２００７)研究表明ꎬ碱提法提取食用菌多糖的得率比水提法高约６倍ꎮＮａＯＨ作为一种强碱ꎬ在一定浓度下能够有效破除细胞壁ꎬ促使多糖－蛋白质间的键裂解以及多糖溶出(孙玉军等ꎬ２０１０)ꎮ因此ꎬ碱法提取羊肚菌多糖能提高多糖得率ꎬ且其提取工艺流程简单㊁高效ꎮ目前ꎬ大多数抗氧化剂是人工合成品ꎬ对人们的健康有一定的威胁ꎮ天然抗氧化剂具有安全㊁无毒的特点ꎬ引起了人们的广泛关注ꎬ寻找高效天然抗氧化剂已成为国内外研究的热点ꎮ研究已发现灵芝多糖(张志军等ꎬ２０１１)㊁茶树菇多糖(余萍等ꎬ２００９)㊁梭柄松孢菇多糖(刘蒙蒙等ꎬ２０１３)㊁木耳多糖(孔沛筠等ꎬ２０１８)㊁鲍鱼内脏多糖(陈胜军等ꎬ２０１９)等具有良好的抗氧化活性ꎬ而有关四川羊肚菌多糖抗氧化活性的研究报告甚是局限ꎬ开展四川北川羊肚菌多糖抗氧性活性的研究显得尤为重要ꎮ本研究对羊肚菌多糖提取工艺进行了优化ꎬ采用苯酚－硫酸法对羊肚菌多糖含量进行测定ꎬ考察了提取温度㊁提取时间㊁碱液浓度㊁料液比对羊肚菌多糖得率的影响ꎬ通过正交实验对碱提工艺进行优化ꎬ测定其体外抗氧化活性ꎬ旨在为四川北川羊肚菌的开发利用提供技术支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１材料和试剂材料:羊肚菌(由四川北川神农有限责任公司提供ꎬ产地为四川北川)ꎮ试剂:２ꎬ４ꎬ６三吡啶基三嗪(ＴＰＴＺ)㊁１ꎬ１￣二苯基￣２￣三硝基苯肼(ＤＰＰＨ)㊁三羟甲基氨基甲烷(Ｔｒｉｓ)㊁乙二胺四乙酸二钠(ＥＤＴＡ￣２Ｎａ)㊁邻苯三酚(ＰＲ)㊁盐酸㊁过氧化氢㊁水杨酸㊁无水乙醇㊁苯酚㊁浓硫酸㊁ＮａＯＨꎬ以上试剂均为分析纯ꎬ购于国药集团化学试剂有限公司ꎮ１.２仪器和设备ＵＶ５０００紫外分光光度计ꎬ安徽皖仪科技股份有限公司ꎻＳＣ￣３６１０低速离心机ꎬ安徽中科中佳科学仪器有限公司ꎻＤＨＧ￣９０３０Ａ电热恒温鼓风干燥箱ꎬ上海申光仪器仪表有限公司ꎻＨＷＳ１２恒温水浴锅ꎬ上海一恒科技有限公司ꎻＪＡ３００３精密电子天平ꎬ上海良平仪器仪表有限公司ꎻＦＫ￣Ａ组织捣碎８８８广㊀西㊀植㊀物３９卷机ꎬ江苏金坛市金城国胜实验仪器厂ꎻｐＨＳＪ￣４Ｆ上海雷磁精密酸度计ꎬ仪电科学仪器股份有限公司ꎻＨＣ￣２０６２离心机ꎬ安徽中科中佳科学仪器有限公司ꎻＪＨ￣ＺＬＳ￣３真空旋转浓缩仪ꎬ上海申光仪器仪表有限公司ꎮ１.３方法１.３.１碱法提取羊肚菌多糖工艺流程㊀羊肚菌粉末ң过筛ң精确称取１ｇ粉末ң碱液提取ң离心(１０００ｒ ｍｉｎ￣１ꎬ５ｍｉｎ)ң滤液ң重复提取ң合并滤液ң真空减压浓缩(至原体积１/３)ң加入３倍体积９５％乙醇(陈丹红ꎬ２０１０)ң４ħ过夜醇沉(溶液中的多糖可被乙醇沉降下来)(薛雅茹等ꎬ２０１７)ң离心(同上)ң沉淀ң干燥ң溶解ң测定吸光度ꎮ１.３.２羊肚菌多糖含量的测定㊀采用硫酸－苯酚法(Ｃｈｕｅｔａｌ.ꎬ２０１８)对羊肚菌多糖得率进行测定:精密称取１０５ħ干燥至恒重的无水葡萄糖纯品２０ｍｇꎬ置于１００ｍＬ容量瓶中超纯水定容作为标准溶液ꎬ精密吸取２㊁４㊁６㊁８㊁１０ｍＬ分别置于１００ｍＬ容量瓶中定容ꎬ分别取１ｍＬ葡萄糖溶液ꎬ随后再加入０.５ｍＬ５％苯酚溶液ꎬ摇匀ꎬ再加入２.５ｍＬ浓硫酸ꎬ混匀ꎬ于４０ħ水浴锅中保温３０ｍｉｎ后ꎬ在４９０ｎｍ波长下测定吸光度ꎮ以葡萄糖含量(ｍｇ ｍＬ￣１)作为横坐标ꎬ以吸光度值作为纵坐标ꎬ得到标准曲线线性回归方程为ｙ＝０.０１５６ｘ＋０.０００４ꎬＲ２＝０.９９９７ꎮ由线性回归方程计算羊肚菌样品中多糖得率ꎮ羊肚菌多糖得率＝(多糖浓度ˑ多糖体积ˑ稀释倍数)/羊肚菌干重ˑ１００％ꎮ１.３.３羊肚菌多糖碱法提取的单因素及正交试验优化１.３.３.１多糖碱法提取的单因素试验㊀在保持其他条件不变的情况下ꎬ分别以不同的提取温度(７０㊁８０㊁９０㊁１００ħ)㊁提取时间(２㊁４㊁６㊁８ｈ)㊁碱液浓度(０.４㊁０.６㊁０.８㊁１.０ｍｏｌ Ｌ￣１)和料液比(１ʒ１５㊁１ʒ２０㊁１ʒ２５㊁１ʒ３０ｇ ｍＬ￣１)为单因素ꎬ考察各因素对羊肚菌多糖得率的影响ꎮ１.３.３.２多糖碱法提取正交试验㊀在单因素试验基础上ꎬ以提取温度㊁提取时间㊁碱液浓度㊁料液比为试验因素ꎬ依次用Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ表示ꎬ并以１㊁２㊁３分别代表各自的低㊁中㊁高水平ꎬ以羊肚菌多糖得率为评价指标确定最佳工艺参数ꎮ正交试验因素及水平编码见表１ꎮ表１㊀正交因素水平表Ｔａｂｌｅ１㊀Ｆａｃｔｏｒａｎｄｌｅｖｅｌｇｒａｐｈ水平Ｌｅｖｅｌ因素ＦａｃｔｏｒＡ提取温度Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ(ħ)Ｂ提取时间Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ(ｈ)Ｃ碱液浓度Ａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ(ｍｏｌ Ｌ￣１)Ｄ料液比Ｓｏｌｉｄ￣ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ(ｇ ｍＬ￣１)１８５３０.７１ʒ１８２９０４０.８１ʒ２０３９５５０.９１ʒ２２１.３.４羊肚菌多糖抗氧化活性研究１.３.４.１多糖的精制㊀利用Ｓｅｖａｇｅ法(郝博慧等ꎬ２０１１)除去粗多糖中蛋白质ꎮ向粗多糖溶液中加入３倍体积的Ｓｅｖａｇｅ试剂(正丁醇ʒ氯仿＝１ʒ５)ꎬ充分振荡７~８ｍｉｎꎬ于４０００ｒ ｍｉｎ￣１下离心５ｍｉｎꎬ静置１０ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎬ重复上述操作ꎬ直至无白色中间层ꎮ合并上清液ꎬ向其中加入３倍体积乙醇置于４ħ冰箱过夜ꎬ离心ꎬ取沉淀ꎬ烘干备用ꎮ１.３.４.２多糖清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定㊀参照Ｌｉｅｔａｌ.(２０１２)的方法ꎬ用９５％乙醇稀释羊肚菌多糖样品ꎬ进行清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定ꎬ重复３次ꎬ以Ｖｃ作阳性对照ꎮ１.３.４.３多糖羟自由基清除能力的测定㊀参照文献(李顺峰等ꎬ２００８)ꎬ用水杨酸法对羟自由基进行测定ꎬ重复３次ꎬ以Ｖｃ作阳性对照ꎮ１.３.４.４多糖超氧阴离子清除能力的测定㊀参照文献(尹巧汕ꎬ２０１２)ꎬ改进如下:以邻苯三酚自氧化法测定羊肚菌多糖对超氧阴离子的清除率ꎬ稀释多糖溶液至０.０２５㊁０.０５㊁０.０７５㊁０.１ｍｇ ｍＬ￣１ꎬ于２５ħ恒温水浴２０ｍｉｎꎬ再加入相同处理的邻苯三酚溶液ꎬ空白实验做相同处理ꎬ５ｍｉｎ内每隔３０ｓ测定一次吸光度ꎮ重复３次ꎬ以Ｖｃ作阳性对照ꎮ１.３.４.５多糖铁离子还原能力的测定㊀参照文献Ｂｅｎｚｉｅ＆Ｓｔｒａｉｎ(１９９６)的方法ꎬ取不同浓度梯度的ＦｅＳＯ４溶液ꎬ制作标准曲线ꎻ取样品浓度分别为９８８７期周益帆等:羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究０.０２５㊁０.０５㊁０.０７５㊁０.１ｍｇ ｍＬ￣１的溶液ꎬ参照参考文献进行试验ꎮ重复３次ꎬ以Ｖｃ作阳性对照ꎮ１.３.５数据统计分析㊀所有试验均重复进行３次ꎬ试验数据均以平均值ʃ标准误(ｘʃｓｘ)表示ꎬ用ＳＰＳＳ２０.０软件计算各抗氧化指标的ＩＣ５０值ꎮ２㊀结果与分析２.１提取羊肚菌多糖的单因素试验２.１.１提取温度对羊肚菌多糖得率的影响㊀图１显示ꎬ在７０~９０ħ时ꎬ随着提取温度的升高ꎬ羊肚菌多糖得率持续增加ꎬ在提取温度达到９０ħ时ꎬ羊肚菌多糖得率达到最高ꎬ为３.８５％ꎻ超过９０ħ后ꎬ得率略微下降ꎮ这是由于提取温度对羊肚菌细胞破坏程度(向东等ꎬ２００４)和多糖分子运动(胡琴汉等ꎬ２０１８)有一定影响ꎬ在一定范围内ꎬ温度越高ꎬ破坏程度和运动速度越大ꎬ越有利于多糖的溶出ꎮ而温度过高可能会破坏多糖结构ꎬ造成多糖得率的下降ꎮ综合考虑ꎬ选择９０ħ为最佳提取温度ꎮ图１㊀提取温度对羊肚菌多糖得率的影响Ｆｉｇ.１㊀ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｏｎｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ２.１.２提取时间对羊肚菌多糖得率的影响㊀图２显示ꎬ羊肚菌多糖得率随提取时间的增加而增加ꎮ在２~４ｈ时羊肚菌多糖得率持续递增ꎮ在提取时间达到４ｈ时ꎬ羊肚菌多糖得率最高ꎬ达４.９８％ꎻ提取时间达到４ｈ之后ꎬ随提取时间增加ꎬ多糖得率增幅不大ꎬ多糖溶出达到最大值(刘继超等ꎬ２０１８)ꎮ因此ꎬ选择４ｈ为最佳提取时间ꎮ图２㊀提取时间对羊肚菌多糖得率的影响Ｆｉｇ.２㊀ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ２.１.３碱液浓度对羊肚菌多糖得率的影响㊀图３显示ꎬ羊肚菌多糖得率随碱液浓度的增加呈先增大后降低的趋势ꎬ碱液浓度在０.８ｍｏｌ Ｌ￣１时ꎬ多糖得率最高ꎬ达到５.０８％ꎬ之后随着碱液浓度的增大而平缓下降ꎮ可能是碱液在一定浓度范围内能显著提高胞内外渗透压差ꎬ增大细胞间距ꎬ使得羊肚菌组织变得疏松ꎬ让多糖溶出更充分㊁快速(蒋玉梅等ꎬ２０１７)ꎮ但羊肚菌多糖在高浓度碱液中可能会降解ꎬ浓度过大ꎬ反而对多糖提取不利(王志刚等ꎬ２００７)ꎮ因此ꎬ选择０.８ｍｏｌ Ｌ￣１为最佳碱液浓度ꎮ图３㊀碱液浓度对羊肚菌多糖得率的影响Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ２.１.４料液比对羊肚菌多糖得率的影响㊀图４显示ꎬ在料液比为１ʒ１５~１ʒ２０(ｇ ｍＬ￣１)的范围内ꎬ多糖得率随料液比增大而增加ꎬ当料液比为０９８广㊀西㊀植㊀物３９卷图４㊀料液比对羊肚菌多糖得率的影响Ｆｉｇ.４㊀Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｓｏｌｉｄ￣ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ１ʒ２０(ｇ ｍＬ￣１)时ꎬ得率最大ꎬ为５.０３％ꎬ在料液比为１ʒ２０~１ʒ３０(ｇ ｍＬ￣１)的范围内ꎬ羊肚菌多糖得率增幅变化不大ꎬ多糖溶出达到最大值ꎮ在一定范围内ꎬ增加溶剂量会增大体系中固相和液相的接触面积ꎬ从而提高多糖浸出的可能性ꎬ使多糖的得率提高(任嘉兴等ꎬ２０１８)ꎮ因此ꎬ选择１ʒ２０(ｇ ｍＬ￣１)为最佳料液比ꎮ２.２正交设计结果与分析基于单因素试验ꎬ影响碱法提取羊肚菌多糖得率的因素有提取温度㊁提取时间㊁碱液浓度㊁料液比ꎬ采用正交试验优化提取工艺ꎬ结果见表２ꎮ由表２极差分析可知ꎬ影响羊肚菌多糖得率的因素按其影响程度的大小排列分别为Ｂ>Ｄ>Ｃ>Ａꎬ最佳提取条件为Ａ２Ｂ３Ｃ２Ｄ２ꎬ即提取温度９０ħꎬ提取时间５ｈꎬ碱液浓度０.７ｍｏｌ Ｌ￣１ꎬ料液比１ʒ２０(ｇ ｍＬ￣１)ꎮ当提取次数为２次时ꎬ在此条件下ꎬ多糖得率为５.３９％ꎮ２.３羊肚菌抗氧化活性测定２.３.１ＤＰＰＨ自由基清除能力㊀ＤＰＰＨ自由基是一种稳定的自由基ꎬ一般用来对抗氧化成分的体外抗氧化性进行评价ꎬ清除率越大表明其抗氧化能力越强(于静等ꎬ２０１８)ꎮ图５结果表明ꎬ在羊肚菌多糖浓度０.０２５~０.１００ｍｇ ｍＬ￣１范围内ꎬ随着羊肚菌多糖浓度增加ꎬ清除ＤＰＰＨ的能力增强ꎬ即清除率与多糖浓度存在量效关系ꎮ在多糖浓度为０.１００ｍｇ ｍＬ￣１时ꎬ羊肚菌多糖和Ｖｃ对ＤＰＰＨ自由基清除率分别达到６６.３２％和４０.２２％ꎬ虽然羊肚菌多糖对ＤＰＰＨ清除率弱于Ｖｃꎬ但羊肚菌多糖仍然表现出较强的清除ＤＰＰＨ自由基的能力ꎮＩＣ５０值为清除５０％自由基所需多糖浓度(徐小伟等ꎬ２０１３)ꎮＩＣ５０值越小ꎬ其对应样品的抗氧化活性越强(李敏等ꎬ２０１５)ꎮ羊肚菌多糖清除ＤＰＰＨ自由基的ＩＣ５０为０.４６８ｍｇ ｍＬ￣１ꎮ梭柄松孢菇多糖(刘蒙蒙等ꎬ２０１３)和木耳多糖(孔沛筠等ꎬ２０１８)的ＩＣ５０分别为３.２７㊁１.４７ｍｇ ｍＬ￣１ꎮ这表明羊肚菌多糖具有较好的ＤＰＰＨ自由基的清除能力ꎮ２.３.２羟自由基清除能力㊀羟自由基是一种强氧化剂ꎬ其清除率是物质抗氧化作用的重要指标(金鸣等ꎬ１９９６)ꎮ图６结果表明ꎬ羊肚菌多糖浓度在０.０２５~０.１００ｍｇ ｍＬ￣１范围内ꎬ随着羊肚菌多糖浓度的增加ꎬ清除羟自由基的能力增强ꎬ即清除率与多糖浓度存在量效关系ꎮ在多糖浓度为０.１００ｍｇ ｍＬ￣１时ꎬ羊肚菌多糖和Ｖｃ对羟自由基的清除率分别达到４４.２８％和８５.６９％ꎬ虽然羊肚菌多糖对ＤＰＰＨ的清除率弱于Ｖｃꎬ但羊肚菌多糖仍然表现出较强的清除羟自由基的能力ꎮ羊肚菌多糖的ＩＣ５０为０.２０８ｍｇ ｍＬ￣１ꎮ李方亮等(２０１１)研究发现香菇多糖和褐蘑菇多糖的ＩＣ５０值分别为０.７０３㊁０.３２０ｍｇ ｍＬ￣１ꎬ说明羊肚菌多糖具有较好的清除羟自由基的能力ꎮ２.３.３超氧阴离子清除能力㊀超氧阴离子自由基可以经过一系列反应生成其他的氧自由基ꎬ引起脂质过氧化ꎬ导致细胞膜结构和功能的改变(杨少辉等ꎬ２０１０)ꎮ因此ꎬ通过对超氧阴离子自由基的清除也能达到抗氧化作用ꎮ图７结果表明ꎬ羊肚菌多糖和Ｖｃ对超氧阴离子都有一定的清除能力ꎬ在羊肚菌多糖浓度０.０２５~０.１００ｍｇ ｍＬ￣１范围内ꎬ随着羊肚菌多糖浓度的增加ꎬ清除超氧阴离子的能力增强ꎬ即清除超氧阴离子的能力与多糖浓度存在量效关系ꎮ在浓度为０.１００ｍｇ ｍＬ￣１时ꎬ羊肚菌多糖和Ｖｃ对超氧阴离子的清除率分别达到６５.９２％和８５.１９％ꎬ两者清除超氧阴离子的能力比较接近ꎬ表明羊肚菌多糖有较强的清除超氧阴离子的能力ꎮ羊肚菌多糖对超氧阴离子的清除率为６５.９３％ꎬ其ＩＣ５０＝０.０２２ｍｇ ｍＬ￣１ꎮ经报道ꎬ茶树菇多糖的ＩＣ５０为１.２８２ｍｇ ｍＬ￣１(余萍等ꎬ２００９)ꎬ１９８７期周益帆等:羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究表２ 碱法提取多糖正交试验结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｆｏｒｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｉｔｈｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ试验编号ＴｅｓｔｃｏｄｅＡＢＣＤ多糖得率Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｙｉｅｌｄ(％)１１１１１４.０１ʃ０.０２２１２２２４.９２ʃ０.０３３１３３３４.９３ʃ０.０３４２１２３４.５３ʃ０.１４５２２３１４.３７ʃ０.０９６２３１２５.３９ʃ０.００７３１３２４.３２ʃ０.０８８３２１３４.５１ʃ０.０４９３３２１４.８４ʃ０.０１Ｋ１１３.８６１２.８６１４.２４１３.２２ Ｋ２１４.２９１３.８１４.２９１４.６３ Ｋ３１３.６７１５.１６１３.６２１３.９７ Ｒ０.６２２.３０.６７１.４１图５㊀羊肚菌多糖对ＤＰＰＨ自由基清除能力Ｆｉｇ.５㊀ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｏｎＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ对于超氧阴离子清除能力来说ꎬ羊肚菌多糖和Ｖｃ的清除率是相近的ꎬ但远远大于茶树菇多糖的清除能力ꎮ说明羊肚菌多糖具有很好的清除超氧阴离子的能力ꎮ２.３.４铁离子的还原能力㊀ＦＲＡＰ法是测定物质还原能力的一种方法ꎬ它可以用来反映样品的总抗氧化活性ꎬ其值越大ꎬ说明抗氧化活性越强(盛冉等ꎬ２０１８)ꎮ图８结果表明ꎬ随着羊肚菌多糖浓度的增加ꎬ多糖对铁离子的还原能力呈线性关系缓慢增加ꎬ与Ｖｃ相比ꎬ羊肚菌多糖的还原能力较低ꎮ图６㊀羊肚菌多糖羟自由基的清除能力Ｆｉｇ.６㊀ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｏｎｈｙｄｒｏｘｙｌｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａＩＣ５０表示样品还原能力达到５０％时所需要的多糖浓度(刘蒙蒙等ꎬ２０１３)ꎮ通过线性拟合得出ꎬ羊肚菌多糖的ＩＣ５０为０.０１４ｍｇ ｍＬ￣１ꎮ经刘蒙蒙等(２０１３)报道ꎬ梭柄松孢菇的还原能力的ＩＣ５０为０.５８ｍｇ ｍＬ￣１ꎬ两者比较ꎬ羊肚菌多糖的还原能力远远大于梭柄松孢菇多糖ꎮ３㊀结论通过单因素和正交试验ꎬ优化了碱法提取羊２９８广㊀西㊀植㊀物３９卷图７㊀羊肚菌多糖对超氧阴离子的清除能力Ｆｉｇ.７㊀ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ图８㊀羊肚菌多糖对铁离子的还原能力Ｆｉｇ.８㊀ＲｅｄｕｃｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｏｎｉｒｏｎｉｏｎｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＭｏｒｃｈｅｌｌａ肚菌多糖的工艺条件ꎬ即加入２０倍体积的０.７ｍｏｌ Ｌ￣１ＮａＯＨ溶液在９０ħ下提取５ｈꎬ经两次提取ꎬ多糖得率达到５.３９％ꎮ本研究通过研究羊肚菌多糖清除ＤＰＰＨ自由基㊁羟基自由基和超氧阴离子的能力以及铁离子的还原能力ꎬ发现其抗氧化能力依次为还原能力>超氧阴离子清除能力>羟自由基清除能力>ＤＰＰＨ自由基清除能力ꎬ以Ｖｃ为对照ꎬ羊肚菌多糖的抗氧化能力均低于Ｖｃꎬ但其ＩＣ５０值显著高于其他食用菌多糖ꎬ说明羊肚菌多糖具有较好的抗氧化活性ꎮ参考文献:ＢＥＮＺＩＥＩＦＦꎬＳＴＲＡＩＮＪＪꎬ１９９６.Ｔｈｅｆｅｒｒｉｃｒｅｄｕｃｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｌａｓｍａ(ＦＲＡＰ)ａｓａｍｅａｓｕｒｅｓｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｏｗｅｒ 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ｎａｎ:ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ.[尹巧汕ꎬ２０１２.九州虫草子座多糖的分离纯化ꎬ理化性质㊁结构及抗氧化活性测定[Ｄ].济南:山东大学.]ＺＨＡＯＳＨꎬＮＯＮＧＧＺꎬＭＥＮＧＬＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.Ｓｔｕｄｙｏｎｅｎｚｙ￣ｍａｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＵｒｅｎａｌｏｂａｔａＬ.ａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＣｈｉｎＪＰｈａｒＴｏｘｉｃｏｌꎬ(４):３４１.ＺＨＡＯＱꎬＫＡＮＧＰＤꎬＱＩＳＷꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１０.Ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｅｓｏｆｍｏｒｅｌｓｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ[Ｊ].ＳＷＣｈｉｎＪＡｇｒｉｃＳｃｉꎬ２３(１):２６６－２６９.[赵琪ꎬ康平德ꎬ戚淑威ꎬ等ꎬ２０１０.羊肚菌资源现状及可持续利用对策[Ｊ].西南农业学报ꎬ２３(１):２６６－２６９.]ＺＨＮＡＧＺＪꎬＬＩＳＦꎬＷＥＩＸＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１１.ＳｔｕｄｙｏｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ[Ｊ].ＣｈｅｍＢｉｏｅｎｇꎬ２８(３):６３－６５.[张志军ꎬ李淑芳ꎬ魏雪生ꎬ等ꎬ２０１１.灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[Ｊ].化学与生物工程ꎬ２８(３):６３－６５.]ＺＩＹꎬＺＨＡＮＧＢꎬＪＩＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｐａｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｅｎｔｉｎａｎｏｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎＨａＣａＴｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪＣｏｓｍｅｔＤｅｒｍａｔｏｌꎬ２６(３):１１０８－１１１４.５９８７期周益帆等:羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究。
羊肚菌多糖药用价值研究进展
龙 正 海 ，纪 其 雄 ，周 惠燕 等 对 羊肚 菌
Ｍ ｒ ｈ ｌ ａ ｓ ｕ ｅ ｔ 多糖 的 体 外 抗 菌 活 性 进 ｏ ｃ ｅ ｌ ｅ ｃ ｌ ｎ ａ 行 初 步 研 究 ［ ］ 方 法 ： 采 用 改 良 药 基 法 和 ９。
３ ５
２０ ６（） ６ ７ ０ ６ ：３ —３ ．
【 】 陈 彦 ， 见 等 ． 羊 肚 菌 胞 外 ８ 潘 多糖 抗 肿 瘤 作 用 的研 究 ． 食 品 科 学 ．
２ ０ ９： ５－ ５ ． ０ ８（） ５ ３ ５ ６
［ 】 龙 正海 ， ９ 纪其雄 ， 惠燕 ． 羊肚 菌 周
了１ ０ ０ 多种 真菌具有 显著的抑癌 活性 ，丽羊肚 菌就是这１ ０ ０ 多种真菌 中的一种 。 周 丽 伟 ， 陈 彦 ， 孙 玉 军 等 ， 研 究 羊 肚 菌
水 提 物 对 四 氯 化 碳 致 小 鼠 急 性 肝 损 伤 的 保 护
［ 】 孙 晓 明 ， 卫 明 ， 素玲 等． 肚 ４ 张 吴 羊 菌 抗 疲 劳 作 用 研 究． 中 国野 生植 物 资 源．
食 药 用 真 菌 多糖 是 一种 非特 异 性 免 疫 促进剂 ，能增 强 网状 内皮 系统 的吞噬 功能 ， 提 高 、 调 节 机 体 免 疫 能 力 ， 具 有 显 著 的 抗 肿 瘤 活性 ，并通 过活 化细胞 阻止癌 细胞 增生 ， 香 菇 多 糖 坑 肿 瘤 功 效 之 后 ， 截 至 目前 已证 明
３ 羊 肚 菌 多糖 药 用 价 值 ． 研 究 发 现 ，羊 肚 菌 有 降血 脂 ， 调 节 免 疫 功 能 ， 抗 疲 劳 、抗 肿 瘤 作 用 ， 并 能 减 轻 癌 症 患 者 放 化 疗 引 起 的 毒 副 作 用 ， 而 起 这 些 作 用 的 是 一 种 称 为 多 糖 的 物 质 下 面 简 要 列 举 部 分关于羊肚菌的药用价值研究成果 。
尖顶羊肚菌活性提取物降血压作用的研究
1.2.2 大鼠生理生化试验
大鼠适应性喂养 3 d 后，随机分为空白对照组、 高血压模型组和阳性对照组，BEMC 低剂量组、中剂 量组和高剂量组共六个组，每组 8 只，自由进食饲料 和水，每三天更换一次水。除空白对照组外，其他各 组每天定时腹腔注射 30 mg/kg· d 的 N-硝基-L-精氨酸 （L-NNA）[6]，每只注射 0.1 mL，空白对照组注射等 量的生理盐水；BEMC 低、中、高剂量组分别灌胃 50
收稿日期：2013-05-09 基金项目：广州市科技计划项目（2012J4300129） 作者简介：王亚辉(1988-)，女，硕士研究生，主要从事食药用真菌活性物 质研究 通讯作者：张松（1964-） ，男，教授，主要从事食药用真菌资源、活性物质 等研究
，从尖顶羊肚菌发酵液提取的胞外多糖提取物具有抗 氧化功效[2]，Huang M et al. 研究发现，尖顶羊肚菌胞 内多糖和胞外多糖均能抑制 LPS 诱导的巨噬细胞分泌 NO，具有免疫调节的功效[3]。罗霞等研究表明，尖顶 羊肚菌菌丝体水提液对酒精引起的大鼠急性胃黏膜损 伤起保护作用[4]。 高血压是一种常见心血管疾病，其主要有中风、 心肌梗死及肾功能衰竭等并发症。我国高血压发病率 呈上升趋势，因此，高血压病的防治具有重要意义。 目前，高血压病的发生机制尚不清楚，它是在各种因 素影响下，血压调节功能失调所致。近几年关于高血 压病的药物治疗有显著进展，特别是关于从食药用真 菌中提取具有生物活性天然成分来预防和治疗高血压
注：与模型组相比，*：P<0.05，**：P<0.01；与空白对 照组相比，△ ：P<0.05，△ △ ：P<0.01。
BEMC 对大鼠收缩压的影响见表 1。 从表 1 可见， 试验开始时，各组间的收缩压水平一致，而给药第 28d，模型组大鼠收缩压比空白对照组提高了 32.79% （P<0.01） ， 这说明 L-NNA 使模型组大鼠收缩压升高， 高血压大鼠造模成功。与模型组相比，给药第 28 d， BEMC 低、 中、 高剂量组分别下降了 17.79% （P<0.01） 、 6.99%和 17.24%（P<0.01） ，这表明，BEMC 低、高剂 量组具有良好的降血压作用。与阳性对照组比较，给 药第 28 d，BEMC 低、高剂量组大鼠收缩压无显著性 差异，这表明，BEMC 低、高剂量组降血压作用效果 与科素亚的效果接近。 BEMC 对大鼠收缩压升高率的影响见表 2，从表 2 可见，给药第 28 d，与模型组相比，除了中剂量组， 其他各组均表现抑制收缩压的升高率 （P<0.01） 。 这提 示，BEMC 低、高剂量组能极显著抑制高血压大鼠的 收缩压升高。
尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究
尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究潘志福;兰瑛;张松【摘要】Inhibitions of the exopolysaccharide extract from Morchella conica on superoxide anion, hydroxyl radical and ABTS free radical were tested for evaluating the in -vitro -antioxidant activity. And through gastric perfusion to aging model mice, effects of the extract on superoxide dismutase activity, content of malondialdehyde and lipofuscin in brains of mice were studied. The results showed that the exopolysaccharide extract inhibited superoxide anion by 43.06％ at 2 mg/mL, scavenged hydroxyl radical by 72. 4％ at 1 mg/mL and ABTS free radical by 77.43％ at 0.1mg/mL. And at 50 mg/(kg · d) of the extract, SOD activities of nude and female mice were increased by 20.70％ and 21.13％ respectively, while contents of LF and MDA were decreased 35. 14％ and 46. 93％, 15. 10％and 15. 61％. It suggests that the exopolysaccharide extract from M. conica has obviously antioxidative and antiaging effects, and had gender differences on the antiaging effects, expressing a superior effect on female mice.%用尖顶羊肚菌胞外多糖提取物检测了对超氧阴离子、羟基自由基及ABTS自由基的抑制作用,用其灌胃衰老模型小鼠,观察其对小鼠大脑超氧化物歧化酶活性(SOD)、脂褐素(LF)和丙二醛(MDA)含量的影响.结果表明:2 mg/mL多糖提取物对超氧阴离子的抑制率为43.06%,1 mg/mL多糖提取物对羟基自由基的抑制率为72.40%,0.1 mg/mL多糖提取物对ABTS自由基的抑制率为77.43%;50 mg/(kg·d)的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性、雌性小鼠脑SOD活性分别提高20.70%、21.13%,LF含量分别降低35.14%、46.93%,MDA含量分别减少15.10%、15.61%.表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化和延缓衰老作用,对雌性小鼠效果略优于对雄性小鼠.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(000)002【总页数】5页(P124-128)【关键词】尖顶羊肚菌;胞外多糖;抗氧化【作者】潘志福;兰瑛;张松【作者单位】华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631;华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631;深圳市国想生物科技有限公司,广东深圳,518114;华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631【正文语种】中文【中图分类】S646尖顶羊肚菌是一种珍稀的食药用真菌，研究发现，它有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血脂及抗菌等作用，具有重要的开发和利用价值[1-4].多糖是其主要的活性物质，然而关于尖顶羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化和延缓衰老的研究尚不多见.本研究通过液体培养获得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物，检测其对超氧阴离子自由基、羟基自由基及ABTS自由基的抑制作用，研究其体外抗氧化活性，并将尖顶羊肚菌胞外多糖提取物灌胃衰老模型小鼠，观察其对小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、脂褐素(LF)、丙二醛(MDA)等的影响来研究其抗氧化作用，为认识其作用机制和开发健康食品提供实验依据.1.1 材料1.1.1 供试菌种尖顶羊肚菌(Morchella conica)，由华南师范大学生命科学学院提供.1.1.2 实验动物昆明种小鼠，SPF级，体质量(20±2)g由中山医科大学动物实验中心提供，饲养环境温度24～26 ℃，许可证号：SCXK(粤)2004-0011.1.1.3 主要试剂 2,2联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、抗超氧阴离子试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒、LF试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；D-半乳糖购自上海伯奥生物科技有限公司；维生素E购自广州星群(药业)股份公司.1.2 方法1.2.1 尖顶羊肚菌胞外多糖的提取将尖顶羊肚菌接种到液体培养基(葡萄糖50 g、NH4NO3 2 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 1 g、维生素B1 0.1 g,蒸馏水定容至1 L，pH调至6.5)，26 ℃、180 r/min培养10 d，收集培养液，浓缩，Sevag法去蛋白，加95%乙醇沉淀，将沉淀物真空冷冻干燥,获得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物[5](简称多糖提取物，下同). 其主要成分为：总糖含量59.40%；蛋白质含量7.88%.1.2.2 多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，测定多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制率，测定的具体方法参照抗超氧阴离子试剂盒说明书.1.2.3 多糖提取物对羟基自由基的抑制作用参照柳红[6]的方法，利用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系测定提取物对羟基自由基的抑制率.1.2.4 多糖提取物对ABTS自由基抑制作用按照文献[7-8]的方法并稍加改进，测定多糖提取物对ABTS自由基的抑制率.1.2.5 小鼠生理生化实验将小鼠随机分为空白对照组、造模组、阳性对照组、多糖提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组共6个组，每组10 只，雌雄各半，自由进食和饮水，造模组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组每天腹腔注射剂量为120 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液0.2 mL，空白对照组注射等量的生理盐水，连续注射42天.低、中、高剂量组分别灌胃尖顶羊肚菌多糖提取物为50、200、800 mg/(kg·d)，阳性对照组灌胃量为800 mg/(kg·d)的维生素E，空白对照组和造模组分别灌胃生理盐水，各组小鼠的灌胃量均为0.2 mL，连续灌胃42天，实验结束后，断颈法取脑，在超声波细胞粉碎仪制成大脑匀浆，离心后，取上清液，用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠的SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，荧光比色法测定LF含量，测定的具体方法均参照试剂盒说明书. 数据采用DPS 3.01 软件进行统计，采用LSD(least significant difference)法(最小显著性差异法)进行方差分析.1.2.6 肝脏切片组织的观察取出小鼠肝脏，体积分数10%的福尔马林溶液保存，按常规石蜡切片制作方法，梯度乙醇脱水处理、石蜡包埋、二甲苯脱蜡，伊红-苏木素染色，在光学显微镜下观察肝脏切片的组织形态.2.1 多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用多糖对超氧阴离子自由基的清除能力以抑制率表示，抑制率越高，说明多糖抗氧化作用越强.图1可见，低质量浓度时，维生素C(Vc)对超氧阴离子自由基的抑制率较高，随质量浓度的增大，多糖提取物和Vc二者对超氧阴离子自由基抑制效果接近.达到2 mg/mL时，多糖提取物的抑制率为43.06%，这表明多糖提取物对超氧阴离子自由基具有一定的抑制作用，且抑制效率与多糖提取物质量浓度呈正相关.2.2 多糖提取物对羟基自由基的抑制作用图2显示，多糖提取物和Vc均具有抑制羟基自由基的能力，它们的抑制能力均与其质量浓度呈正相关.抑制率为50%对应的提取物质量浓度为0.81 mg/mL;当质量浓度为1 mg/mL时，提取物对羟基自由基的抑制率为72.4%.这表明多糖提取物对羟基自由基具有一定的抑制能力.2.3 多糖提取物对ABTS自由基的抑制作用图3显示多糖提取物对ABTS自由基具有较好的抑制作用，随着多糖提取物质量浓度的增加，对ABTS自由基的抑制能力逐渐加强，当抑制率为50%时，分别对应的多糖提取物质量浓度为0.026 mg/mL、Vc 质量浓度为0.027 mg/mL.当质量浓度为 0.1 mg/mL时，提取物对ABTS自由基的抑制率为77.43%.说明多糖提取物对ABTS自由基有较强的抑制能力.2.4 多糖提取物对小鼠脑SOD活性、LF和MDA的影响从表1可知，多糖提取物在50 mg/(kg·d)的剂量下使雄性小鼠脑SOD活性提高20.70%(P<0.01),脑LF含量降低35.14%(P<0.01)，脑MDA含量降低15.10%；其对雌性小鼠脑SOD活性提高21.13%(P<0.05)，脑LF含量降低46.93%(P<0.01)，脑MDA含量降低15.61%(P<0.05)，小鼠SOD活性比阳性对照组高， LF含量比阳性对照组低.200 mg/(kg·d)多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低24.32%(P<0.01)，MDA 含量降低18.68%；其使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低45.91%(P<0.01)、19.41%(P<0.05)，但是对雄性和雌性小鼠脑SOD活性均与模型组没有显著差异.800 mg/(kg·d)的多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低29.73%(P<0.01)，MDA含量降低19.13%(P<0.05)，脑SOD活性则比模型组降低13.20%，但没有显著差异(P>0.05)；其能使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低32.65%(P<0.01)、23.07%(P<0.05)，使脑SOD活性提高了18.02%(P<0.05). 图4表明，通过与模型组比较,多糖提取物对小鼠的LF影响最大，本实验所设置的3个剂量组中，50 mg/(kg·d)(低剂量组)使LF含量增加优于阳性对照组，且具有性别的差异，对雌性小鼠的LF作用略优于对雄性小鼠的作用.Y轴表示各组与模型组比较，SOD活性增加的百分比以及LF、MDA减少的百分比.2.5 小鼠肝脏切片的组织形态模型组雄性小鼠肝组织切片(图5a)中细胞核凝聚，细胞质皱缩，细胞呈现干枯状，表现出衰老状态；50 mg/(kg·d)(低剂量组)多糖提取物灌胃的雄性小鼠肝组织切片(图5b)边界清晰，细胞形态较为正常.衰老是生物界的普遍现象,一般与体内自由基含量有关.细胞组织受到自由基攻击后，生物大分子发生变形、断裂，破坏细胞结构和功能，从而导致机体衰老[9]. 羟基自由基及超氧阴离子等自由基引发的体内脂质过氧化是机体衰老的重要原因[10].本研究发现，尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基具有抑制作用，并呈一定的量效关系.这表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有清除自由基，阻断自由基反应链，降低自由基对机体组织、细胞结构及生物大分子的损害作用.机体存在多种抗氧化物酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等具有相互协调作用来清除自由基[9].超氧化物歧化酶能有效清除自由基，发挥抗氧化作用，MDA是自由基攻击机体组织导致脂质过氧化的主要产物，而LF是机体老化的代谢产物，能反映其氧化损伤的程度.食药用菌多糖能降低过氧化脂质含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力[11].牛肝菌胞外多糖能有效清除超氧阴离子自由基和抑制羟基自由基产生，减少小鼠肝组织MDA含量[12].栎金钱菌活性提取物通过提高衰老模型小鼠血清SOD活性、减少肝MDA含量和LF含量，具有良好的抗氧化和延缓衰老效果[13].本研究发现，50 mg/kg·d尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能提高雌性小鼠SOD活性21.13%，降低LF含量46.93%和MDA含量15.61%.表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物可提高SOD活性，抑制了体内羟基自由基、超氧阴离子等自由基，保护机体组织免受自由基损伤，减少了丙二醛、脂褐素等衰老产物，从而延缓机体衰老.食药用菌活性提取物抗氧化与延缓衰老的效果有性别差异.栎金钱菌活性提取物对雄性小鼠的抗衰老效果比雌性好[13].本研究发现尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对雌性小鼠的延缓衰老效果要略优于对雄性小鼠.这可能与尖顶羊肚菌胞外多糖提取物调节雌性激素及类似物有关，因为雌性激素可以促进抗衰老基因的表达，减少体内自由基产生，某些雌性激素类似物还具有延寿的效果[14].尖顶羊肚菌胞外多糖提取物是一种无毒具有开发潜力的天然抗氧化剂资源，它能有效提高脑SOD活性，降低脑LF和MDA含量，抑制羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基，具有良好的抗氧化效果.Key words： Morchella conica; exopolysaccharide; superoxide radical; hydroxyl anion radical; ABTS free radical; antioxidant; antiaging【相关文献】[1] 陈彦,潘见,周丽伟,等.羊肚菌胞外多糖抗肿瘤作用的研究[J].食品科学，2008,29(9)：553-556. CHEN Yan,PAN Jian,ZHOU Liwei，et al.Antitumor activity of extracellular polysaccharides from Morchella conica Pers [J].Science of Food,2008,29(9)：553-556.[2] 张利平,陈彦,王子尧,等.羊肚菌胞外多糖免疫活性研究[J].中国食用菌,2009,28 (3)：47-49. ZHANG LiPing，CHEN Yan，WANG Ziyao，et al.Immunological activities of polysaccharide from Morchella conica (L.) Pers[J].Edible Fungi of China,2009,28 (3)：47-49.[3] 明建,曾凯芳,赵国华,等.羊肚菌水溶性多糖PMEP-1降血脂作用研究[J].食品科学,2009，30(17)：285-288.MING Jian,ZENG Kaifang,ZHAO Guohua,et al.Hypolipidemic activity of water soluble polysaccharide PMEP-1 from Morchella esculenta (L.) Pers[J].Science of Food,2009，30(17)：285-288.[4] TURKOGLU A,KIVRAK I,MERCAN N,et al.Antioxidant and antimicrobial activities of Morchella conica Pers.[J].African Journal of Biotechnology,2006,5 (11)：1146-1150.[5] LEE J H,KIM J H,ZHU I H,et al.Optimization of conditions for production of pullulan and high molecular weight pullulan by Aureobasidium pullulans[J].BiotechnologyLetters,2001,23:817-820.[6] 柳红,张静.不同南瓜多糖体外清除羟基自由基作用的研究[J].武汉植物学研究,2007，25(4)：356-359.LIU Hong,ZHANG Jing.Study on the scavenging effect of different pumpk in polysaccharide on hydroxide free radicals in vitro[J].Journal of Wuhan Botanical Research,2007，25(4)：356-359.[7] LI G,MIN B S,ZHENG C,et al.Neuroprotective and free radical scavenging activities of phenolic compounds from Hovenla dulcis [J].Archives of PharmacalResearch,2005,28(7):804-809.[8] LEE I K,YUN B S.Hispidin analogs from the mushroom Inonotus xeranticus and their free radical scavenging activity[J].Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters,2006,16(9):2376-2379.[9] 王玉华,叶加,李长龄,等.冬虫夏草提取物延缓衰老实验研究[J]，中国中药杂志,2004,29(8)：773-776.WANG Yuhua，YE Jia，LI Changling，et al.An experimental study on antiaging action of Cordyceps extract[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2004,29(8)：773-776. 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羊肚菌多糖提取工艺优化及抗氧化性研究
山西农业科学2018，46（7）：1199-1203羊肚菌多糖提取工艺优化及抗氧化性研究任嘉兴,张锦华,白宝清,范三红（山西大学生命科学学院，山西太原030006）摘要:以山西省安泽县野生羊肚菌为原料，通过单因素和响应面试验，对羊肚菌多糖的提取工艺进行优化。
结果表明，最佳提取工艺为：液料比41∶1（mL/g ）、提取温度88℃、提取时间3h ，在此条件下，多糖理论得率为4.24%，实际得率为4.24%±0.17%。
抗氧化结果表明，当多糖质量浓度为1mg/mL 时，对DPPH 自由基和羟自由基清除率分别为52.21%和79.77%，且具有还原能力。
关键词:羊肚菌；多糖；响应面法中图分类号:TS201.2文献标识码:A文章编号:1002-2481（2018）07-1199-05Study on Optimization of Extraction Technology of Polysaccharideand Its Antioxidant Activity fromREN Jiaxing ，ZHANG Jinhua ，BAI Baoqing ，FAN Sanhong（College of Life Science ，Shanxi University ，Taiyuan 030006，China ）Abstract ：With Morchella esculenta as raw material,process was optimized by single factor method and response surface method to extract polysaccharides,and the antioxidant ability of polysaccharides was studied.The results showed that optimum extraction process of polysaccharides from Morchella esculenta was as follows:liquid-solid ratio was 41∶1（mL/g ）,extraction temperature was 88℃,extraction time was 3h.Under these conditions,the polysaccharides yield was 4.24%.Antioxidant results showed that when the polysaccharides concentration is 1mg/mL,the scavenging rates of DPPH radicals and hydroxyl radicals are 52.21%and 79.77%,respectively,and has a certain reduction ability.Key words ：Morchella esculent ;polysaccharides;response surface methodology收稿日期:2018-05-23基金项目:山西省重点研发计划重点项目（201703D211019，201703D211012-1）；山西省专利推广实施资助专项（20171002）；2016年山西省高等学校教学改革创新项目(J2016003)；2016年山西省研究生教育改革研究课题（2016JG26）作者简介:任嘉兴（1993-），女，山西忻州人，在读硕士，研究方向：食品科学。
Rhizobium sp. N613胞外多糖的抗氧化活性
铁氰化钾(天津化学试剂三厂), 三氯化铁(天津化学试剂三厂), 三氯乙酸(天津大茂化学试剂厂), 过氧化氢(天津化学试剂三厂), 硫酸亚铁(天津化学试剂三厂), 水杨酸钠(天津化学试剂三厂), 邻苯三酚(遵义佳宏化工有限责任公司), 硫代巴比妥酸(Solarbio)。以上试剂均为分析纯。
取红细胞悬液0.5 mL, 加不同浓度的REPS样品, 最后加3%的H2O2 (REPS在反应体系中终浓度分别为0.14、0.29、0.57、0.86和1.14 mg/mL), 混匀, 37?C温浴60 min后, 再用生理盐水稀释至合适倍数, 离心。上清液于λ415波长处测定吸光度。按下述公式计算氧化溶血抑制率:
O2?·清除率(%) = (1 ? △A/△A0) × 100
其中: △A0为邻苯三酚自氧化速率, △A为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率
1.4.4 氧化溶血的抑制试验[11]: 红细胞悬液的制备: 健康小鼠摘除眼球采血, 加入1 mg/mL的肝素钠0.2 mL, 制成抗凝血, 先以5000 r/min 离心10 min, 移弃血浆和白细胞, 再向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水, 混匀, 离心, 弃上清液, 反复2次, 洗涤红细胞, 将红细胞制成5%的悬浮液。
本文旨在研究锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(REPS)的抗氧化活性, 为拓展REPS的应用范围提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Rhizobium sp. N613胞外多糖(以下简称REPS), 由本实验室以Rhizobium sp. N613为生产菌株发酵纯化制得, 经检测其纯度达99%以上。
Rhizobium sp. N613胞外多糖的抗氧化活性
陈艳丽 任盛 魏国琴 吕利华 赵良启*
液体深层发酵羊肚菌胞内多糖提取、结构分析及抗结肠癌作用研究
液体深层发酵羊肚菌胞内多糖提取、结构分析及抗结肠癌作用研究羊肚菌(Morchella esculenta L.)是世界公认的珍稀食用菌,营养价值高,保健效果显著,含有多种活性物质,如多糖、蛋白质、矿物质、微量元素、膳食纤维、维生素等,具有降血脂、抗疲劳、抗病毒、消炎、抗肿瘤等诸多功效。
羊肚菌一直处于野生状态,人工栽培技术尚不完善,产量不稳定,导致价格偏高,限制了活性物质的开发,尤其是羊肚菌多糖的研究还限于初级层面,没有开展深入的功效机理及分子结构研究。
本论文以液体深层发酵羊肚菌菌丝体为研究对象,首次使用高压脉冲电场技术在室温下提取菌丝体胞内多糖,过程中无升温,保证多糖分子结构的完整性;使用多种除杂、纯化技术得到两种中性羊肚菌多糖和两种酸性羊肚菌多糖,鉴于多糖产量和分子量大小的原因,选择产量高的中性多糖进行抗结肠癌活性研究;通过检测相关凋亡基因和蛋白的表达,发现MEPN-B-Ⅱ通过两条路径激活caspase-3,诱导HT-29细胞发生凋亡,控制结肠癌细胞增殖。
论文详细分析了MEPN-B-Ⅱ分子结构,获得了单糖组成和糖苷键信息,并首次观察到具有抗结肠癌活性的羊肚菌多糖分子是以一种微球型的微观形态存在,多个分子聚集在一起呈无定型多晶体状态。
本论文为深入研究液体深层发酵羊肚菌多糖生物活性和空间结构打下理论基础,主要研究内容和结论如下:(1)本论文分别用超声波-波微协同法和高压脉冲电场法两种技术提取羊肚菌胞内多糖。
通过单因素试验和响应面分析法优化两种方法的提取工艺条件。
超声波-微波协同法提取多糖的最佳工艺条件为:超声功率250 W,微波功率220 W,提取时间7 min,多糖产量为4.425%。
高压脉冲电场法提取多糖的最佳工艺条件为:电场强度18 k V/cm,脉冲数7,料液比1:27 g/m L,多糖产量为5.693%,比超声波-微波协同法产量提高了28.66%。
通过扫描电镜观察两种方法提取后的细胞结构,发现高压脉冲电场法提取后细胞壁破碎彻底,内含物溶出充分,而且整个过程在常温下进行,羊肚菌多糖分子无热降解,提取效率高,耗时短。
羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究
羊肚菌多糖提取及其抗氧化活性研究周益帆;杨滢;卢会敏;王静;刘松青;王芳【摘要】为了探讨碱法提取羊肚菌多糖的工艺条件并测定其抗氧化活性,该研究以四川北川羊肚菌为原料,采用碱法提取羊肚菌多糖,利用苯酚-硫酸法对羊肚菌多糖得率进行测定,并通过单因素探讨提取温度(70、80、90、100℃)、提取时间(2、4、6、8 h)、碱液浓度(0.4、0.6、0.8、1.0 mol?L-1)、料液比(1:15、1:20、1:25、1:30 g?mL-1)对羊肚菌多糖得率的影响,同时采用正交试验优化提取工艺,对其抗氧化活性进行测定.结果表明:在提取温度90℃、提取时间5 h、碱液浓度0.7 mol?L-1、料液比1:20(g?mL-1)条件下得到的羊肚菌多糖得率为5.39％.羊肚菌多糖具有较强的清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的能力和较好的还原能力,其IC50分别为0.468、0.208、0.022、0.014 mg?mL-1,抗氧化能力依次为还原能力>超氧阴离子清除能力>羟自由基清除能力>DPPH自由基清除能力.优化后的羊肚菌多糖提取工艺合理、可行,且羊肚菌多糖具有较强的抗氧化活性.【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2019(039)007【总页数】9页(P887-895)【关键词】羊肚菌;多糖;碱提法;工艺优化;抗氧化活性【作者】周益帆;杨滢;卢会敏;王静;刘松青;王芳【作者单位】成都师范学院化学与生命科学学院, 成都 611130;成都师范学院化学与生命科学学院, 成都 611130;成都师范学院化学与生命科学学院, 成都611130;乌海节能监察监测中心, 乌海 016000, 内蒙古;成都师范学院化学与生命科学学院, 成都 611130;成都师范学院化学与生命科学学院, 成都 611130【正文语种】中文【中图分类】Q946羊肚菌是珍稀的野生食(药)用菌之一，属于真菌界子囊菌门子囊菌纲盘菌目羊肚菌科羊肚菌属，因其形似羊肚而得名(赵琪等，2010)。
响应面法优化羊肚菌多糖制备工艺及其抗氧化活性研究
２０２０年１月第２期医学食疗研究响应面法优化羊肚菌多糖制备工艺及其抗氧化活性研究李益，杨小斌，武林贺，袁诚，邓颖诗中药提取分离过程现代化国家工程研究中心／广州白云山汉方现代药业有限公司，广东 广州 510240【摘要】探讨水提醇沉制备羊肚菌多糖的最佳工艺及抗氧化活性研究。
以羊肚菌多糖得率为指标，考察料液比、浸提时间及浸提温度对羊肚菌多糖含量的影响，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面法对提取工艺进行优化，并采用DPPH自由基清除法、·OH自由基清除法对羊肚菌多糖的抗氧化活性进行评估。
结果表明：多糖适宜的提取工艺参数：料液比为1:12，提取温度为92℃，提取时间为78 min，在此条件下，多糖含量为3.65%。
羊肚菌多糖具有较好的抗氧化能力，对DPPH和·OH自由基的IC50分别为3.55 mg/mL和4.63 mg/m L。
【关键词】菌多糖；提取工艺；DPPH；·OH；抗氧化活性[中图分类号]TQ218 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249(2020)02-0023-02羊肚菌Morchella，因外形像羊肚子而得名，又被称为羊雀菌、羊肚蘑等，是羊肚菌属真菌的统称，是一种名贵食药用菌，味道鲜美，营养丰富，具有极高的保健功能[1]。
其中多糖是羊肚菌的一种主要有效成分，有研究表明，羊肚菌多糖具有增强免疫力、抗菌、抗肿瘤、抗疲劳等多种生理 活性[2]。
本实验采用常规水提醇沉法来提取羊肚菌中的多糖，运用响应面优化提取温度、料液比、提取时间对多糖含量的影响，测定DPPH和·OH自由基评价羊肚菌多糖的抗氧化活性，为香菇、银耳、茯苓、云芝进一步的开发成健康食品提供科学依据。
1 材料与方法1.1材料与试剂 羊肚菌；三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸、甲醇、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、葡萄糖、95%乙醇、DPPH，H2O2、Na2HPO4，NaH2PO4、FeS04，均为分析纯。