细胞生长促进试验筛选新生牛血清

Abstract Objecti ve To establish a screening method of serum suitable for culture of human diploid cells. Methods Two methods of determination of cell doubling time and cell growth promot ion assay were used to screen the newborn calf serum ( NCS) . A total of 11 in 15 different bat ches of NCS were select ed and used for large scale cell culture so as to observe the cel l growt h stat us. Results There was no significant correlat ion between the cell doubling time and relative growth rate ( P> 0 05) . The NCS which the relat ive growth rate of cells cultured in was above 75% was more suit able for the growth of human diploid cells in large scale culture. Conclusion The met hod of Cell growth promotion assay is bett er than the one of determination of cell doubling t ime in reflect ing the growth ability of human diploid cells in t he serum. Cell growth promot ion assay is a more suitable method for screening NCS used for human diploid cells cult ure.
Key words Newborn calf serum; Cell doubling t ime; Cell growt h promot ion assay; Human diploid cell
在细胞 培养中, 新 生牛血 清 ( NBCS) 具 有极其 重要 的 作用, 但由于血清是 一种 很复 杂的混 合物, 往 往会 因小 牛 产地、出生后 采 血 时 间 等 不 同, 造 成 其 批 次 间 质 量 的 差 异[1] , 所以众多 应用 新生牛 血清 进行生 产的 企业, 会通 过 各种筛选方 法, 选择 适合 本企 业细胞 培养 的、质量 稳定 的 血清。本实验拟 通过 对细 胞倍 增时 间测 定, 生 长促 进试 验 两种筛选方法进行 比较, 以 建立适 合人 二倍 体细胞 培养 的 最佳血清的筛选方法。
+ ++ + + +
死细 胞的定为细 胞生 长+ + + ; 细胞 维持 时呈长 梭形, 折 光性强, 一个视野 见少量 死细 胞, 无细 胞卷脱 的定 为细 胞 维持+ + + , 结果相对生 长率 97% 以上 的血 清细胞 生长 维 持为+ + + , 6 号、13 号 血清 细胞 倍增 见表 1。
表 1 两种方法筛选新生牛血清结果
细胞倍增时间 血清编号
( h)
1
24 68
相对生长率
(%) 91 4
细胞生长 细胞维持
ND
ND
2
22 15
92 3
ND
ND
3
23 77
94 5
ND
ND
4
20 36
97 6
+ ++ + + +
5
18 95
108 3
+ ++ + + +
6
19 76
93 2
++
++
7
18 34
tracelboluses [ J] . Lipids, 2005, 46: 1474~ 1483.
[ 7] Taouis, Mohammed. N 3 Polyunsaturated fatty acids prevent the defect
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材料与方法
1 新生牛血清 15 批次筛选新生牛血清分别由杭州四季 青 生物工程材 料有 限公 司, 郑州 佰安生 物工 程有限 公司, 兰 州民海生物工程有 限公司 提供。对 照新 生牛 血清由 杭州 四 季青生物工程材料有限公司提供。 2 人胚肺二倍体细胞 人胚肺 二倍体 细胞 ( KMB17) 由 本
参考文献
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( 收稿日期: 2007 12 03)
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生长促进试验通 过减 少血 清的 浓度, 每 7d 传代 一次, 连续传代三次的方 式, 这样 可以 真实地 检测 出每批 血清 支 持细胞增殖的能力, 而不受预先使用的 残余培养 基的影响, 减少实验误差[ 6] 。本实 验结 果也说 明细 胞生长 促进 试验 比
细胞 倍增时间测定更能 客观 地反 映血清 促人 二倍体 细胞 的 生长能力, 是筛选适合 人二 倍体 细胞培 养的 血清的 较佳 方 法。
作者单位: 浙江省医学科学院, 浙江杭州 310013
所细胞室提供。 3 细胞培养液 由本所配液室提供。 4 细胞倍增时间测定[ 2] 4 1 人胚肺二倍 体细胞 ( KMB17) , 代 数 23 代, 经 胰蛋 白 酶消化, 加入含 10% 筛选血清细胞培养液, 细胞计数, 按 1 ! 104 / ml 的细胞浓 度接 种于 24 孔 板, 每 批血 清 接种 8 孔, 5% CO2 培养箱 37 ∀ 培养, 每 天计 数 1 孔 细胞, 连 续观 察 1 周。 4 2 细 胞 倍 增 时 间 的 测 定, 取 细 胞 峰 值 前 一 天 计 得 数 ( Y) 、接种细胞数 ( X) 及生长时间 ( T) 计算倍增时间 , 倍 增时间= T/ A A= log2Y / X。 5 细胞生长促进试验[ 3] 5 1 人胚肺二倍 体细胞 ( KMB17) , 代 数 23 代, 经 胰蛋 白 酶消 化, 加入 无 血清 的细 胞培 养液, 将 细 胞浓 度调 至 2 ! 105, 取 9 5ml 注入 25cm2 塑料瓶, 再加入 0 5ml 待筛选或 对 照血清, 配 制成 5% 血清 浓 度的 生 长 液, 每 批血 清 培养 3 瓶, 37 ∀ 培养。 5 2 7d 后, 细胞经胰蛋白酶消化, 将每批血清的 3 瓶细 胞
105 0
+ ++ + + +
8
21 19
9
18 53
10
19 67
11
26 24
12
20 41
97 0 113 0 106 5 82 6 99 5
+ ++ + ++ + ++
ND + ++
+++ +++ +++
ND +++
13
20 09
93 0
++
++
14
21 74
94 5
++
++
15
20 26
98 0
讨论
血清是细 胞培养 中重 要的原 材料, 对 培养 起着 关键 的 核心作用。应用血 清培养 二倍 体细胞 进行 生产的 企业, 常 规按 % 中国生物制品主要原辅材料质控标 准& 2000 版规定, 通过 细胞生长曲 线、倍增 时间 等来筛 选血 清。但在 大规 模 细胞培养中, 有时会发 生血 清促 细胞生 长能 力与筛 选时 不 一致, 影响细胞培养, 从而影响到生物制品的质量。