新生牛血清病毒检测血吸附法
新生牛血清中乙脑抗体的检测及其方法的建立
测定方法 。 具有灵敏度高 、 重复性好等优点 ， 可真实
反映牛血清 中抗体中和乙型脑炎病毒（ 简称乙脑病 毒） 的能力。对 ｌ ６个批号 的新生牛血清用该方法 进行了抗乙脑病毒抗体的测定 ， 并对其结果进行 了
分析 比较 。
Ｐ Ｕ法 ， 中国生物制品规程》ຫໍສະໝຸດ 进行。 Ｆ 按《 ¨ ６ 待检血清
控标准》 进行质控外， 还应进行乙脑抗体的检测。
关键词 ： 蚀斑减少 中和试验 ； 乙脑病毒抗体 ； 新生牛血清 中图分类号 ：３ ３ ３ Ｒ ７ ． １ 文献标 识码 ： Ａ 文章 编号 ： ０ —６ ３（０ ６ ０ ４ ４ －３ １ ５５ ７ 。２０ ） １） ３０ ０ ０
Ｐａ ｕ ｅ ｕ ｔ ｎｎ ｕｒｌ ａｉｎｔｓ（ ＲＮ ｌｑ ｅｒｄ ｃ ｏ ｅ ｔａ ｚｔ ｅｔ Ｐ Ｔ）ｉ ｄｔｃ ｏ ｆ ｎｉ ａ ａ ｅｅｅ ｃｐ ａｉｓａ ｔ ｏ ｉｓｉ ｅ ｂ ｒ ｏ ｉ ｉ ｏ ｎ ｅｅｔ ｎｏ ｔＪｐ ｎｓ ｎ ｅｈ ｌｉ ｎｉ ｄｅ ｎ ｗ ｏｎ ｂ ． ｉ ａ — ｔ ｂ ｎ
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屋 ０ ６年第 ３ ０ ４卷第 １ 期
Ｐｏ ｃｏｉ ｍ ｕ ｏ Ｆｂ ２ ０ Ｖ １ ４Ｎ ． ｒｇｉ Ｍｉ ｂｏ Ｉ ｍ ｎｌ ｅ ． ０６． ０ ｎ ｒ ｌ ．３ ｏ １
新生牛血清中乙脑抗体的检测及其方法 的建立
王 静， 李裕惠， 栗克喜 （ 成都生物制品研 究所 ， 成都 ６ ０２ ） １０３
ｓ ｏ ｌ ｅ ｔｓｅ ｎ ｎ ｗｂ ｒ ｏ ｉｅ ｓ ｌ ｉ ． ｈ ｕ ｄ ｂ ｅ ｔ ｄ ｉ ｅ ｏ ｌ ｂ ｖｎ ｅ－ １ ｌ ｕ１
Ｋｅ ｒ ｓ ｌｑ ｅｒｄ ｃｉｎ ｎ ｕｒｌ ａｉｎｔｓ；Ａｎｉ ａ ａ ｅｅｅ ｃ ｐ ａｉｓａ ｔ ｏ ｉｓ ｙ ｗｏ ｄ ：Ｐａ ｕ ｅ ｕ ｔ ｅ ｔａｉ ｔｏ ｅｔ ｏ ｚ ｔ． ｐ ｎ ｓ ｎ ｅ ｈ ｌ ｉ ｎｉ ｄｅ ；Ｎｅ ｏｎ ｂｖｎ ｅｔ ｌ Ｊ ｔ ｂ ｗｂ ｒ ｏ ｉｅｓ ｒｎ ｌ
浅论新生牛血清病毒检测
病病毒 ，感染狂犬病 病毒的动物常表现 为极度兴奋和狂躁 ， 病死率高 ， 且 由于该种 病毒可感染所 有温和动物 ， 因此对 于
疫苗生产的危害极大。（ ３ ）牛副流感病毒是通过感染 牛体 ， 引起呼吸道疾病的一 种病 毒 ， 多发于欧美等 国家。（ ４ ）牛腹
是现代牛血清病毒检测 的重要手段之一。 实验用到的不同种
１ ． ２ 新生牛血清病毒种类 新生牛血清的病毒通常为４ 种，
能够引起生物体 的不 同病变。（ １ ）牛细小病 毒 ， 常发生于我
国从 国外引进种牛的地区 ， 是一种接触性传染病 。（ ２ ）狂犬
类 的免疫荧 光抗体ห้องสมุดไป่ตู้、 牛 肾细胞 、 新生 牛血清等 主要试剂应保 存在符合 生物安全要求 的洁净柜 中， 实验操作 时 ， 在牛 肾细
近年来 ， 生物制 品在生产 以及应用方面取得 了不小 的进 展， 与社会生活 的联系也愈发紧密 。由于新生牛血清 中病毒 来源广 、 种类多 ， 因此 针对新 生牛血 清的病毒检测 十分必要 。
采血 到病 毒检测 ， 力求将污染 降到最低 ， 保证新 生牛血清 的
质量 。
２ 新生牛血清病毒检测方法
制备 ， 以牛肾细胞为例 ， 制备前须 对新生 牛血清进行 灭活处
理， 避免影响测定准确率。通过培养后阴性及阳性细胞病变
现今生产新生牛血清 的企业众多 ， 为 了统一 品质 ， 国家 出台
了相关政策和规范 ， 加大 了监管力度 ， 力求从 源头上控制牛
的产生情况 ， 检测病毒种类以及活力 ， 判断新生牛血清质量 。 采用细胞培养法需要较长 的操作时 间， 且特异性以及敏感性 较差 ， 因此检出效果有待提高。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性
该方法的另一突出优点是自动化，因此可以用于大量动物的 筛选。
朊病毒
Positive Control Dilution to End-Point
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性 牛的病原与病毒安全性关注的重点 欧盟对牛血清病毒检测的要求 病毒分类与牛的某些病毒 牛血清的病毒安全检测技术 血清的病毒清除/灭活工艺 病毒安全实验室的部分研究工作
DNA病毒－－牛腺病毒
牛腺病毒（Adenoviruses） 分类地位：腺病毒科，哺乳动物腺病毒属 形态特征：无囊膜，90nm 理化特性：对酸、碱、有机溶剂有抵抗 分2个主要亚群，10个血清型。
DNA病毒－－牛腺病毒
尚不清楚是否人兽共患，但可以转化人细胞。 能用细胞感染检测，1群感染牛胚肾细胞并迅速产生细胞 病变，2群感染牛睾丸细胞，有时需要盲传。 也可用PCR检测。
WHO和各国管理当局、行业协会等高度关注医药产品生产 使用细胞基质的安全问题，尤其是潜在病毒污染的问题。
疫苗病毒安全性的可能污染途径：活疫苗种毒的污染，制 备工艺中原、敷料的污染和其他需要考虑的问题。 其中，牛血清的质量控制与病毒安全检测最受关注。
牛血清的重要性与生物药品的病毒安全性 牛的病原与病毒安全性关注的重点 欧盟对牛血清病毒检测的要求 病毒分类与牛的某些病毒 牛血清的病毒安全检测技术 血清的病毒清除/灭活工艺 病毒安全实验室的部分研究工作
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工艺
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
值得关注的对象
潜在性感染的病毒： （1）隐性感染而不引起任何疾病的病毒； （2）某些持续性感染的病毒； （3）处于潜伏状态的病毒。 由于机体生理状态（如怀孕）、外界环境的变化，机体抵 抗力下降等因素，这类病毒可能大量增殖或引起疾病的发 生。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
• Prusiner 1982: the plaque protein is the infectious agent (prion)
• The normal, non-infectious Protein (PrPC) is encoded by the host and is mainly expressed on lymphocytes and neurons
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
DNA病毒－－牛多型瘤病毒
BPyV倍受关注，它可能是一种人兽共患病，饲养人员、 兽医的体内有较高水平的抗体，而对大多数人群则缺乏 抵抗力。 可以感染灵长类细胞，包括人的细胞。 影响细胞培养的结果。 检测： 能用细胞感染检测，在猴肾细胞可以产生特异性的病变， 即胞浆、胞核空泡化。 PCR检测，使用特异性的引物扩增、杂交或测序。
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
牛血清的病毒安全检测与病毒灭活工 艺
朊病毒
PrPC
PrPSc
Refolding model
(template directed)
Seeding model (nucleated crystallization)
PrPC
最新新生牛血清病毒检测血吸附法
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术
畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术畜禽血样的采取是动物免疫抗体监测和疫病监测工作中的重要内容。
在畜禽血样的采取过程中，其做好采前准备、采血方法、采集时机、血样运送、保存和处理等环节，都直接关系到免疫抗体检测结果的准确性及可靠性，笔者通过多年的实际操作，积累了一定的方法和经验，供同行参考。
1采血前的准备采血前应穿好工作服，备好保定器械，v形管、v形管架，一次性注射器(采血针)、记号笔、酒精棉球、干棉球、相关表格等。
16号针头、9号和7号头皮针若干，镊子、剪刀、酒精(75％)、药棉若干、保定棍和绳2副、一次性5ml真空管若干。
2血样的采集根据畜禽种类、所需血样或血清的数量确定采血部位、器械及采血量。
禽类采翅静脉、猪采前腔静脉或耳静脉、牛采颈静脉或耳静脉、羊采颈静脉：禽类用5ml一次性医用注射器，猪、牛、羊用10～20ml 一次性医用注射器：禽类采血量不少于2ml，猪、牛、羊不少于5ml。
2．1猪血样采集2．1．1猪的保定 (1)徒手保定法：适用于中、小猪，可根据具体情况采用正提、倒提或横卧方法保定。
保定人抓住猪的双耳向上提起，两腿夹住猪背。
也可用双手抓住猪的两后肢，向上倒提后，两腿夹住其肩胸部。
保定中猪时，保定者应背靠圈栏增加稳定性。
横卧保定由一人或二人操作。
保定者从背侧将猪后肢及前肢或耳抓住后，用力提起横卧放倒，并紧压其头部及后躯。
(2)器械保定法：适用于成年公猪、母猪或野性较强的猪。
一种为鼻绳保定，即用直径1cm、长3～4m的一根绳子，一端结成直径为20cm的活套，将其套于猪的上颌犬齿后方后，收紧环套，另一端拉紧或缠绕于栏杆上。
另一种为鼻捻棒保定，即用1m长木棒，一端栓一直径20cm的绳套，同上法套用于猪上颌犬齿后方后，捻转收紧绳套将猪保定。
2．1．2采血猪血样采集耳静脉或前腔静脉，猪的采血最好是空腹，在早上或午后进行。
采血场所有充足的光线；室温夏季最好在25～2 8℃，冬季15～20℃为宜。
活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用
活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的研究活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用。
方法将活性炭加入小牛血清去蛋白提取液中，过滤后检测蛋白含量及吸光度值,呼吸活性及氨基酸的含量。
结果与无活性炭对照比较，加入活性炭后小牛血清去蛋白提取液吸光度值、多肽含量均明显下降;呼吸活性及氨基酸含量没有明显变化。
结论活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽有吸附作用。
【关键词】活性炭;小牛血清去蛋白提取液;多肽The Absorption Effect of Active Carbon on the Polypeptide in Calf Serum Abstract Protein-freeLI Xin,WANG Tie (Liaoning Ahon Pharmaceuticals Corporation Limited,Jinzhou 121000 China)Abstract：Objective To study the effects of active carbon on the polypeptide in calf serum abstract protein-free. Methods Put active carbon into calf serum abstract protein-free; and determine protein content, absorbance, amino acid content and breath nature afterfiltration.Result Compared with the group without active carbon, absorbance and protein content decreased ,while breath nature and amino acid content did not decrease.Conclusions Polypeptide was absorbed by active carbonKey words：active carbon; calf serum abstract protein-free; polypeptide活性炭是一种多孔径的炭化物，有极丰富的孔隙构造，具有良好的吸附特性，它的吸附作用藉物理及化学的吸咐力而成的,其外观色泽呈黑色。
牛血液采集及血清分离技术
科 技 转 化
牛 血 液 采 集 及 血 清 分 离 技 术
李 强
（ １ ． 甘 肃 省 张 掖 市 甘 州 区 动 物疫 病 预 防控 制 中心 ， 甘肃 张 掖 ７ ３ ４ ０ ０ ０ ； ２ ． 国家 肉牛 产 业 技 术 体 系 张 掖 综合试验站 ， 甘肃 张掖 ７ ３ ４ ０ ０ ０ ）
无 菌试 管或小 瓶 中。分 离 后 得 到 的血 清 ， 应 尽 快用 冷 藏或冷 冻方 法保存 ， 及 时送 到实 验室 进行检 验 。
４ 常 见 不 良“ 采血法” 导 致 的结 果
的 方 法进 行 血 清 分 离 。采 血 及 血 清 分 离成 功 率 １ ０ ０ 。
关 键词 ： 畜禽 ； 血液采 集技 术 ； 血 清分 离技 术 ； 体会
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ １ ． ３ ４ 文 献标 识 码 ： Ｂ 文章编号 ： １ ０ ０ １ － ９ １ １ １ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ８ ０ — ０ ３
套， 采 血登记 表 （ 见表 １ ） 、 记录用笔、 玻 璃 铅 笔 及 冷
藏箱 、 消毒液 （ 用 于工作 人员及器 械 消毒） 等。
表 １ 采 血 登 记 表
序 号 畜 主 地 址 联 系 方 式 畜 别 畜号 或 耳 标 号 采 血 日期 实 验 室 收 到 日期 血 清 质 量
年 月 日
血 清 编 号 备 注
检 验 单 位
检验人员 ：
２ 牛 的采 血 技 术
２ ． １ 牛 血 液 采 集源自技 术 毒， 再以 ７ ５ 酒精棉球脱碘消毒； 如 在 颈 部 左 侧 采 血（ 以左侧 为例 ） ， 用 左手 的食 指 、 中指 及 无 名指 （ 或 半握 拳） 压 住采血 部位稍 下 （ 向心） 端 的颈静 脉 ， 使 静 穿戴好 工作 服 、 帽、 口罩 、 胶 脉 回流受 阻 ， 静脉 怒 张 ， 这 时用 右 手 拇 指 、 食指 及 中 指持 紧消 毒后并 干燥 的 １ ８ ＃针头 ， 用 飞针 方 式扎 入 颈 静脉 （ 如用真 空采 血 方 法 ， 因 针头 尖 锐且 较 细 ， 轻 轻 即可刺 入颈静 脉 ， 当针头 后方 见血后 ， 应迅 速将连
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血吸附法检测新生牛血清病毒
1原理
有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1病毒
牛副流感病毒。
2.1.2细胞
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；
2.1.3试剂
无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；
MEM培养基：细胞基础培养基；
0.85%生理盐水：洗脱血细胞；
胰蛋白酶：消化细胞；
鸡血；
豚鼠血。
2.1.4仪器设备
①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；
②洁净工作台；
③倒置显微镜；
④冰箱；
⑤离心机；
⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒
将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法
2.2.1细胞制备
以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制
取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离
心10一15分钟，压积血球，备用。
取一年龄以上来享公鸡，翼下静脉采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
鸡血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
按比例吸取鸡血球和豚鼠血球，用0.85%生理盐水配制成0.2一0.5%鸡豚红细胞混合悬液备用。
2.2.3供试品检测
取培养到期的接种供试品的每种细胞2瓶，观察细胞病变，细胞形态。
弃培养液，用生理盐水洗三次，加入鸡红细胞和豚鼠红细胞混合悬液5一10mL/瓶，覆盖细胞表面，置2一8℃作用30分钟，然后再置作用20一25℃作用30分钟，弃掉红细胞悬液，用生理盐水反复洗三次，显微镜下观察。
2.2.4阴性对照品制备
用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
2.2.5阳性对照品制备
将按照2.1.5方法将制备好的牛副流感病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
2.3结果
阳性对照应出现血细胞吸附。
供试品检查不出现血细胞吸附为阴性，判定合格。
供试品检查出现血细胞吸附，判定不合格。
附注：
牛副流感病毒为典型的血吸附病毒，因此利用血吸附法对病毒的存在与否进行确认。
副流感病毒中的HA可以促使动物红细胞的聚集，根据聚集情况判定病毒的存在或者判定病毒的滴度。
副流感病毒有一定的致病性因此在实际的操作中应特别注意实验人员的安全防护。
并且应在实验操作前应进行病毒滴度检测，最终的病毒滴度实验浓度应控制在200CCID50左右，但应注意所采取的方法也应为血吸附法，根据血细胞沉淀来判断该病毒的滴度而不是根据细胞的病变情况来确定，因为该病毒为胞内病毒，其对细胞的病变情况可能不是特别典型和明显。
阴性对照实验的选择同样需要对牛血清进行热灭活处理，副流感病毒对温度较为敏感，在常温条件下暴露时间过长也会影响细胞的正常培养，因此阴性新生牛血清的选取可以选择经过56℃灭活的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清，同样也可以选取经过培养无特异微生物的合格新生牛血清。
而在热灭活也会给新生牛血清带来负面的影响，在较热条件下新生牛血清的加热会导致血清中沉淀，会严重影响血吸附实验的结果判定，应需要在实际的实验操作中加以重视。
供试品的冻融次数对牛副流感病毒的影响较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多会对病毒的生长带来一定的影响，从而对病毒的检出率也有很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数不能多余8次，否则就会对供试品中牛副流感病毒的判定产生偏差，并且还会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。
由于牛副流感病毒对温度的敏感性较强，因此在供试品制备实验中应尽量避免高温条件以及其他化学试剂的污染，而且在操作过程中应尽快的完成整个实验操作，避免可能存在的病毒由于长时间暴露而使活性降低。
在实际的新生牛血清保存中是放置在零下20℃的条件下进行保存，在此条件下牛副流感病毒会处于休眠的状态，所以仍然存在在实际使用过程中污染的可能。