细胞中各种位置蛋白提取
细胞蛋白提取方法4页
细胞蛋白提取方法4页细胞蛋白提取是生物学研究中的一个重要步骤，可用于分离纯化目标蛋白质、检测蛋白质表达水平、研究蛋白质功能等。
本文将介绍四种常见的细胞蛋白提取方法，并分析它们的优缺点。
一、化学法化学法是最早使用的一种细胞蛋白提取方法。
其基本思路是将细胞破碎后，借助化学性质将蛋白质从细胞质中萃取出来。
1.酸性抽提法酸性抽提法最早用于提取细菌蛋白，后来逐渐应用于动物和植物细胞中，适用于水溶性蛋白。
操作时，将细胞用冷酸淀粉液破碎，使核酸和金属离子与蛋白质结合，然后用盐酸或硫酸调酸至pH3.5-4.0，离心沉淀细胞碎片，收集上清液并加入饱和的氨烷或三甲基乙酸酯，离心沉淀，洗涤并重悬。
优点：操作简单，适用于小规模提取。
缺点：易造成蛋白质的氨基酸脱羧、失活以及相互聚集等。
2.酒精沉淀法酒精沉淀法是利用酒精沉淀蛋白来提取细胞蛋白。
操作时，将细胞破碎，用氯化钠等盐类调节细胞液的离子强度，加入80%酒精沉淀蛋白质，沉淀后用70%酒精洗涤，除去脂肪和亲水性蛋白，最后重悬。
优点：适用于固体细胞组织和肌肉等纤维化组织，可提取胞外基质蛋白。
缺点：蛋白质失活易，不能提取不稳定蛋白质。
二、物理法物理法是利用物理力学原理将细胞破碎并萃取蛋白质。
这种方法适用于大量细胞的破碎和蛋白质的快速提取。
1.高压均质法高压均质法是传统的细胞蛋白提取方法。
操作时，将细胞悬液通入高压均质器，使之经过高压作用下击碎，高速剪切和磨擦等力作用，使细胞膜和核膜破裂，细胞内蛋白质释放出来。
优点：破碎效率高，提取速度快。
2.超声波破碎法超声波破碎法是近年来出现的一种物理法。
操作时，利用声波振动作用于细胞，使其中的蛋白质破碎并散布入溶液中。
优点：破碎效率高，可以提取水溶性和非水溶性蛋白，对蛋白质保护较好，适用于活性蛋白的提取。
缺点：超声波会产生热量和产生气泡，容易导致蛋白失活和降解，需要控制时间和频率。
三、生物法生物法是利用生物学原理将细胞破碎并清除细胞碎片。
蛋白提取方法
蛋白提取方法蛋白是生物体内一种重要的有机化合物，具有多种生物学功能。
在生物医学研究、食品工业、药物研发等领域，蛋白的提取和纯化是非常重要的工作。
本文将介绍几种常见的蛋白提取方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
1. 细胞裂解法。
细胞裂解法是一种常见的蛋白提取方法，它通过破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
通常采用机械方法（如超声波破碎、高压破碎）或化学方法（如洗涤剂裂解）来实现细胞裂解。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大多数类型的细胞。
2. 亲和层析法。
亲和层析法是一种通过蛋白与特定配体之间的亲和作用来实现蛋白提取的方法。
常用的亲和层析配体包括金属离子、抗体、亲和标记物等。
通过将这些配体固定在固定相上，再将混合蛋白溶液通过柱子进行层析，从而实现对目标蛋白的选择性提取。
这种方法对蛋白的纯化效果较好，但成本较高。
3. 凝胶过滤法。
凝胶过滤法是一种通过分子大小差异实现蛋白提取的方法。
通常采用多孔性凝胶作为固定相，将混合蛋白溶液通过凝胶柱进行层析，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，对蛋白的形态和功能影响较小，适用于对蛋白分子大小要求较高的应用场景。
4. 盐析法。
盐析法是一种通过蛋白与盐溶液中离子相互作用的差异实现蛋白提取的方法。
在盐浓度逐渐增大的过程中，蛋白质的溶解度会发生变化，从而实现对蛋白的分离和提取。
这种方法操作简单，成本较低，适用于对蛋白的选择性提取要求不高的场景。
5. 超滤法。
超滤法是一种通过膜的孔径大小选择性分离蛋白的方法。
通常采用超滤膜将混合蛋白溶液进行过滤，从而实现对蛋白的提取。
这种方法操作简单，对蛋白的分离效果较好，但需要注意膜的选择和操作条件的控制。
总结。
蛋白提取是生物医学研究、食品工业、药物研发等领域中的重要工作。
本文介绍了几种常见的蛋白提取方法，包括细胞裂解法、亲和层析法、凝胶过滤法、盐析法和超滤法。
每种方法都有其特点和适用场景，研究人员可以根据具体的实验要求选择合适的方法进行蛋白提取工作。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
总蛋白的提取
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6 ）于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）（7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取：（1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
（2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。
一个人，来这世间，必须懂得一些人情事理，才能不断成长。
就像躬耕于陇亩的农人，必须懂得土地与种子的情怀，才能有所收获。
一个女子，一生所求，莫过于找到一个懂她的人，执手白头，相伴终老。
细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行：
1. 细胞收集：从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。
可以使用细胞培养方法培养细胞，或者从活体组织中分离细胞。
2. 细胞破碎：将细胞用适当的方法破碎，以释放细胞内的蛋白。
可以使用机械方法（如超声波破碎器或高压细胞击碎器）或化学方法（如洗涤液或界面活性剂）来破碎细胞。
3. 蛋白质提取：使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心，以去除细胞碎片和细胞核。
随后，可以使用不同的方法来提取膜蛋白，例如溶解细胞膜并提取蛋白。
4. 蛋白质纯化：使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。
这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
5. 蛋白质浓缩：将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。
可以使用蛋白质浓缩技术，例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。
6. 蛋白质鉴定：利用蛋白质检测方法，如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等，确定提取的蛋白质的纯度和数量。
细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。
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这个protocol应该可以满足大部分人的需求。
我孤陋寡闻，因需要检测可以溶于两种不同去污剂的蛋白，看到一篇文献里蛋白提取方法，完全被折服了。
太强悍了，蛋白还可以这样提。
我以前一直以为裂解液裂解后，沉淀里面没有蛋白了，现在才发现沉淀里还含有大量不溶于裂解液里去污剂的蛋白。
故将这个protocol发出来供我和一样的新手学习。
我以前是裂解细胞，离心，测浓度，然后直接往整管里加loading buffer，再离心取上清，看过这个步骤之后才知道，加loading buffer后沉淀里的许多蛋白会再次溶解。
同一种蛋白可能存在溶于不同去污剂的成份。
最后我有一个问题，一瓶细胞按下列步骤提取的蛋白后，能否比较该瓶中同一蛋白在含不同去污剂的裂解液中含量的多少？怎样选择内参？
For cell fractionation analysis, a general protocol was used which allowed for separation of cells into cytoplasmatic, nuclear and membrane/cytoskeleton fractions. Briefly, cells were harvested with a rubber policeman in chilled 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors, and ruptured by repeated passage through a 21-gauge needle. Nuclei were collected by centrifugation at 1000 ×g for 3 min and lysed with 1% SDS-lysis buffer. Centrifugation of supernatants at 21,460 ×g for 1 h at 4 °C gave membrane/cytoskeleton as pellet and the cytosolic fraction as supernatant. Membrane/cytoskeleton pellets were then resuspended as whole, SDS-solubilized membrane/cytoskeleton fraction (Tot) with 1% SDS-lysis buffer. Otherwise, membranes were fractionated into Tx-soluble (Sol) and Tx-insoluble (Insol) phases by treatment with TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors). Centrifugation at 21,460 ×g for 60 min gave a supernatant constituted by the Tx-soluble membrane phase and a residue pellet representing the Tx-insoluble, cytoskeleton-linked membrane phase which was resuspended in SDS-buffer.
翻译版本一
细胞分部分离一般的实验设计是将细胞分离为细胞质的、核的、细胞膜/细胞骨架这几个部分。
简单来说就是，
1. 用一端包有橡皮的玻璃棒从冷却的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors 中收获细胞，用21号针使传代细胞破裂。
2. 通过离心（1000 ×g for 3 min ）收集细胞核，用1% SDS-lysis buffer溶解。
3. 所得上清液再离心（21,460 ×g for 1 h at 4 °C ）得到的片状沉淀物为细胞膜/细胞骨架，上清中的蛋白为细胞质部分的。
4. 片状的细胞膜/细胞骨架沉淀用1% SDS-lysis buffer全部重悬。
另外，用TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)处理细胞膜，将膜被分为可溶和不可溶两部分，通过离心（21,460 ×g for 60 min ）取沉淀，用SDS-buffer将细胞骨架相连的膜重悬。
翻译版本二
最好全部冰上操作。
1，弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂，有钱可以买pierce的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（英文好像是cocktail）。
2，在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。
3，1000g*3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。
4，将A管上清21460g*1h 4 °C离心，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。
对于沉淀根据需要有两种处理，
A, 将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。
B, 将沉淀用含TritonX-100裂解液(100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。
来自文献PTPRK negatively regulates transcriptional activity of wild type and mutated oncogenic beta-catenin and affects membrane distribution of beta-catenin/E-cadherin complexes in cancer cells. Cell Signal. 2008 May;20(5):872-83.
本人只需得到总蛋白中溶于Triton X-100和不溶于Triton X-100的蛋白。
操作如下，
lysis buffer
2*lysis buffer 500ul(150mM NaCl, 2%Troton X100,100mM Tris (pH 7.5))
Inhibitors 40ul
MillQ water 460ul
在六孔板中每孔加入200ul裂解液，置于4 °C摇床30min后（也可置于冰上吹打裂解），4 °C 离心14000g*10min,上清即为溶于Triton X-100（Sol）的蛋白，沉淀使用100ul 1*上样缓冲液(里面含有SDS) 溶解上清，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的蛋白。