蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤组织蛋白提取是一种常见的实验方法，在生物医学研究中广泛应用。
通过组织蛋白提取，可以获取到目标蛋白质，并进行后续的分析和研究。
本文将详细介绍组织蛋白提取的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.准备所需材料：待提取组织样本、PBS缓冲液、RIPA裂解缓冲液、PMSF（丙烯酰氨基苯甲酸）、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒等。
2.消毒工作台和实验器具，保证实验环境干净卫生。
3.根据所需样本量选择合适的试管或离心管，标注好编号和样品信息。
二、样品收集1.收集新鲜组织样品，尽可能避免冷冻保存，因为长时间冷冻会对蛋白质结构产生影响。
2.将组织放置在PBS缓冲液中进行清洗和去除表面污物。
3.将组织切成小块或粉碎成粉末状，以便更好地进行裂解。
三、裂解1.将组织样品加入RIPA裂解缓冲液中，按比例加入PMSF，PMSF的浓度一般为1mM。
2.将混合物放置在冰上静置30分钟，使细胞膜破裂，并释放出蛋白质。
3.使用离心机进行离心，离心速度一般为12000rpm，离心时间约为10-15分钟。
四、收集蛋白1.将上清液收集到新的离心管中，去除沉淀和杂质。
2.使用SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒进行蛋白质浓度检测和电泳分析。
3.根据实验需要进行后续处理，如Western blot、ELISA等实验。
五、注意事项1.操作过程中需保持洁净卫生，避免污染样品。
2.PMSF是一种有毒化学物质，在使用时需佩戴手套和防护眼镜，并注意避免吸入或接触皮肤。
3.组织样品应尽可能新鲜，并在保持完整性的情况下进行裂解。
如果组织保存时间过长或受到损伤，则可能会影响蛋白质提取的效果。
4.离心时应注意离心速度和时间，避免过度离心导致蛋白质损失。
5.在蛋白质浓度检测和电泳分析中，应根据实验需要选择合适的试剂盒和仪器，并按照说明书进行操作。
总之，组织蛋白提取是一项重要的实验技术，在生物医学研究中具有广泛的应用。
通过正确的操作步骤和注意事项，可以提高蛋白质提取的效率和准确性，为后续实验打下坚实的基础。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
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蛋白提取原理
蛋白提取原理
蛋白质是生命体内最基本的物质之一，它参与了生物体内的几乎所有生命活动。
因此，蛋白质的提取和纯化对于生物学研究、食品加工、药物开发等领域具有重要意义。
蛋白提取的原理主要包括细胞破碎、蛋白质溶解和分离纯化三个步骤。
首先，细胞破碎是蛋白提取的第一步。
细胞膜的破裂是蛋白质提取的前提条件，只有将细胞完全破碎，才能使蛋白质充分暴露在溶液中，有利于后续的溶解和分离。
常用的细胞破碎方法包括机械破碎、超声波破碎、冻融破碎等，这些方法可以有效地破坏细胞壁和细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
其次，蛋白质的溶解是蛋白提取的关键步骤。
细胞破碎后，蛋白质通常以固体形式存在于细胞溶液中，需要将其溶解到溶液中。
蛋白质的溶解受到多种因素的影响，如pH值、离子强度、温度等。
在蛋白质的溶解过程中，需要选择合适的缓冲液和溶解条件，以保证蛋白质的完整性和活性。
最后，蛋白质的分离纯化是蛋白提取的最终目的。
在蛋白质溶液中，通常含有大量的杂质和其他蛋白质，需要通过分离纯化的方
法将目标蛋白质从混合溶液中分离出来。
常用的分离纯化方法包括离心、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，这些方法可以根据蛋白质的特性和目的进行选择，最终得到纯度较高的目标蛋白质。
总之，蛋白提取的原理是一个复杂的过程，需要综合运用生物化学、生物物理学、分子生物学等多个学科的知识。
只有深入理解蛋白提取的原理，才能选择合适的方法和条件，从而获得高质量的蛋白质样品。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。
而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。
3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。
4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。
5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。
三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。
2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。
3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。
四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。
2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。
3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。
4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。
五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。
4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。
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提蛋白及WB的步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、
当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、
开低温高速离心机
细胞裂解液配制：
1ml cell lysis
10ul NP-40（离心机后）
25ul 焦磷酸钠
40ul NaF
1ul β-甘油磷酸
2 ul Na3VO4
1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）
10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）
细胞裂解和收集
1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左
右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。
3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往
上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。
细胞破碎
4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。
（超声波破碎仪的铁棒不
要碰到离心管的壁和底部）
超声波设置：
工作功率5% 工作时间3min
开机时间15s，关机时间30s
温度0度，
报警温度1度
5.4℃、13000r/min，离心15min。
（离心机用后一直保持打开的状态，）
蛋白保存
6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。
-80℃保存。
注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。
样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度
1、测空白板，选差异较小的孔。
BCA测定法波长570，Bracford：595
2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。
取5ul标准蛋白+45ul PBS
3、加样：
浓度0
BSA（ul）0481216
PBS（ul）20161284
4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS
5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量，
一般防止损耗，多算一个样。
6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。
（手不能碰板的底部，影响测定结果）
7、计时30min
8、配分离胶，灌胶，加水封。
9、计时20min。
10、测蛋白：先振板、再设置参数。
11、计算上样体积:
12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。
13、打开干式加热器
10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用
水补足。
(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul)
标记离心管
加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。
100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致）
11、计时10min ，变性10min。
12、安装电泳槽:
电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次）
液面刚覆盖胶，不能有气泡。
13、上样：maker 上样量为3ul。
依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去
14、电泳
分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。
浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。
转膜
准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜
PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。
用海绵和滤纸之前先浸湿。
转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。
三层滤纸和膜都需要赶气泡。
安装转移槽：加转子、冰盒，安装时夹子面朝上
15、转膜电压100V 90min。
（视蛋白大小而定，蛋白分子小的可适当缩短时间）
16、取膜晾干、剪个角作为标记，保鲜膜保存4℃。
孵育抗体
1、膜的活化：把膜晾干，甲醛浸泡（回收）膜数秒、无菌水洗3次、TBST洗2次。
2、封闭：配封闭液：3 % 的牛奶：4ml TBST+ 脱脂奶粉，混匀、涡旋。
3、4℃封闭一小时、盖盖子。
4、TBST 洗三次、每次10 min 。
（封闭液与一抗相同则不用洗）
5、一抗孵育：加一抗，1:1000（比例视情况定）、密封孵育、盖盖子。
6、4℃过夜孵育。
7、回收一抗(回收到对应的离心管，立即放回4℃冰箱)
8、TBST洗三次、每次10 min。
9、二抗孵育：加二抗，室温孵育1h。
10. 回收二抗，TBST洗3次，每次10 min(最后一次不要倒掉)（可以准备洗膜用的东西：检
查显影液是否能用）
显影
11.准备显影的东西：显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、
配发光液：A:B 1:1、放小黑屋里。
剪好保鲜膜、铺在板上，做好准备。
12. 最后一次TBST洗完后，拿到小黑屋，关门、开红灯。
13.先剪X光片、右上角做个记号（位置看个人习惯），
14.将膜上的液体吸干（卫生纸上稍微吸干），放板上，定一个3min 计时器，加上发光液，开始计时。
观察发光现象，当看到发光时，压片。
15. 压片：将膜反扣在保鲜膜上，不能产生气泡。
每次压片都记时，先从2min开始。
15．压片结束后，放在显影液里，轻轻摇晃至看到条带，用镊子夹至水中浸泡，清洗数秒，再放置定影液内。
16.等膜洗完后，拿至外间，用自来水清洗光片，晾干。