单分子检测与荧光相关光谱
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大连理工大学现代分析化学第十一章分子发光光谱
第一节
2. 荧光分析法的特点2.
第二节
（2）
（3
2.激发光谱与荧光2.
(3)激发光谱与发射光谱的关系(3)
3. 荧光的产生与分子结构的关系3.
(2) 化合物的结构与荧光(2)
4. 影响荧光强度的因素
第三节
荧光用的样品池须用低荧光的
形状
（3）
由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。
3. 三维光谱技术3.
4.4.磷光检测技术磷光检测技术
第三节
2.2.定量依据与方法定量依据与方法
（2）定量方法
3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用
4. 磷光分析法的应用4.
第四节
2.化学发光反应类型2.
（2
化学发光的特点4.化学发光的特点4.。
第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
荧光相关光谱在生物化学领域中的应用
荧光相关光谱在生物化学领域中的应用黄茹;周小明【摘要】荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一种通过监测荧光涨落从而获得单分子水平的分子扩散行为信息的技术.FCS高灵敏度的优点使得它已发展成为一种可以在活体外与活体内检测分子浓度、扩散系数、结合和解离常数等参数的有力工具.荧光互相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy,FCCS)是FCS技术的进一步发展,其大大扩展了FCS技术的应用范围.本文介绍了FCS及其衍生技术的原理及其在生物化学领域的应用.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2013(022)004【总页数】5页(P289-293)【关键词】荧光相关光谱;分子诊断;生物化学【作者】黄茹;周小明【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)的实质是监测带有荧光基团的物质在激光作用体积内的扩散情况。
FCS可以测定＜10-15 L微区内的荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度的涨落，其微小的观测体积使它成为一种非常重要的单分子监测技术，并且最大程度上降低了系统中非检测物质的荧光对目标物检测造成的影响。
FCS在20世纪70年代形成初步的概念［1］，经过在检测器、自相关电子元件和共聚焦显微镜等方面的一系列发展，到90年代已经发展成为一种被广泛应用的光谱技术［2，3］。
其中，激光共焦技术通过减少样品的照射体积来抑制散射光的影响，从而使FCS的检测达到了单分子水平。
Rigler等首先解决了FCS信噪比低的问题，使得单分子荧光检测成为了可能［4］。
分子荧光光谱法
即在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度
成正比，这是荧光法定量的基础。
2. 荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
产生荧光的必要条件是 分子必须具有能吸收激发光的结构通常是共轭双键结构； 必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后 子数与吸收的激发光的量子数的比值
第九章
分子荧光光谱法
Molecular fluorescence spectroscopy
9.1
9.1.1
荧光光谱法基本原理
分子的激发与失活
1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改变， 分子仍处于单重态。
9.2
9.2.1
荧光分析仪器和荧光法的应用
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分 析，也可用于测绘激发光谱和荧
光光谱。第一单色器选择激发光
波长（＞250nm的紫外光），故 称为激发单色器。第二单色器
（荧光单色器）与激发光入射方
向垂直，并选择荧光波长，可提 高方法的选择性和准确度。
量子产率（Ф）。
F = K′（I0—I） 根据朗伯-比尔定律，lg I 0 =εbc I
则 I I0 e
2.303bc
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
F K I 0 (1 e 2.303bc )
假设εbc＜0.05
F = K’I02.303 εbc 当I0一定时 F = K· C (K =K’I02.303 εb)
三重态 有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。
分子荧光光谱法
F = k (I0 - I)=KC
返回
28
Instrumentation
Perkin- -Elmer 204
特殊点：有两个单色器，光 29 源与检测器通常成直角。
23
A.
Light Sources
1. Xenon arc lamps
They give broad continuum spectra in UV/Vis region (200 -1000 nm, λmax at ~ 500 nm) Very high radiation power
Natural Fluorescence
Green fluorescent protein (GFP)
From jellyfish（水母）
Widely applied in molecular biology (2009 Nobel Prize)
Red fluorescent protein (DsRed)
originally isolated from the Indo Pacific sea anemone(海葵) relative Discosoma species h
5
4
分子荧光和磷光光谱分析法
产生机理
1、荧光\磷光的产生
激发后分子的多重性可能改变( S/T两态). 单重态: 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机
物分子的基态是单重态。当处于基态的一对电子中的一个
被激发到较高能级，其自旋方向没有改变，分子仍处于单 重态。 三重态: 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态 6 能量较激发单重态低。
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，要以辐射或
无辐射跃迁的方式回到基态。
单分子荧光检测的原理、方法及应用
0 前言
随着生命科学的迅速发展，人们对生命现象 的研究已深入到单细胞、单分子层次，许多传统的 分析方法与手段面临极大的挑战。单分子检测是 近十年来迅速发展起来的一种超灵敏的检测技 术，为分析化学工作者打开了一扇新的大门。现 在，人们不仅可以在溶液中对单个分子进行检测 和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行 测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，特别 是能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功 能之间的信息。单分子检测有电化学法与光学 法，本文仅就单分子荧光检测的原理、方法及应用 作一简单阐述。
分子荧光检测的原理、方法及其在生命科学中的应用。
关键词：单分子检测；荧光；评述
中图分类号：06 - 1
文献标识码：A
Fluorescence Detection of Single Molecule and Its Applications
WANG Yi-iin
（ COiiege Of Chemistry and Chemicai Engineering，Guangxi University，Guangxi Nanning 530004 PRC）
从单分子水平上研究蛋白质与核酸的相互作 用可为人类基因组的研究提供许多新机会。实时 观察单个酶分子在 DNA 上的结合和运动可揭示 许多新问题，如 DNA 结合蛋白在许多非特异性结 合位点中如何找到特异性位点的，RNA 聚合酶在 转录时是如何运动的。单分子检测技术已用于直 接观察基因表达过程［24］。研究表明，荧光标记的 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链作直线滑行，为滑动 是寻找启动子的机制提供了直接证据。研究表 明，在转录过程中 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链移
图 1 分子能级图
2 方法
单分子荧光检测的技术关键在于确保被照射 的体积中只有一个分子与激光发生作用以及消除 杂质荧光的背景干扰。采用高效滤光片，利用共 焦、近场和消失波激发，可达此目的。根据所用仪 器及对样品激发方式的不同，单分子荧光检测大 体可分为以下 4 种。 2. 1 近场扫描光学显微镜
单分子检测与荧光相关光谱..
，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子 的特殊位置和行为。
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测器
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测器
7.荧光相关谱(FCS)
12
荧光相关谱技术是怎样实现的
把激光光束会聚到样品上，激发特定区域的荧光，由探测器 监测荧光强度变化(荧光分子或粒子的扩散或化学反应，使得激 发区域内粒子在其平衡浓度的波动，造成荧光强度的波动),进行 荧光自身相关运算，获取粒子的某些信息，如溶液的浓度、粒子 扩散系数等。
⎯⎯ The Key Laboratory of Biomedical Photonics of Ministry of Education, China ⎯⎯ 2005/12/28
⎯⎯ The Key Laboratory of Biomedical Photonics of Ministry of Education, China ⎯⎯ 2005/12/28 7
1996 The ConfoCor from Carl Zeiss is the first automated fluorescence correlation spectrometer 1997 The confocal laser scanning microscope LSM 510 developed by Carl Zeiss is a very compact and user-friendly system. 1999 Carl Zeiss sets the standard for fully automated dual channel cross correlation spectrometry: ConfoCor2 2000 With the combination of the ConfoCor 2 with the LSM 510 to form the :ConfoCor2/ LSM 510 combi the age of biophysics dawns in cell biology. An ingenious technique is made available to a wide variety of users.
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概述
根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单 个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测 系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单 个分子仍可被检测到数千光子信号。 检出限约为10-13mol/L
分子发光分析
概述
3.两个基本要求：
在被照射的体积中只有一个分 子与光子发生相互作用，可以 通过调整体系的浓度或密度来
单分子酶催化反 23.6.2单分子ATP酶活性研究
肌球蛋白的S1亚基通过白蛋白-生物素卵蛋白涂层结合到玻璃表面，在S1片段 上有一个ATP酶活性，能切割Cy3标记 的ATP。蛋白质也有Cy3标记，使得单 一酶分子位于滑道上，ATP酶标签定位 后，绑定在S1片段上的Cy3被光漂白， 以消除其散射光的影响。当Cy3-ATP / ADP酶固定化之后，会发生荧光强度的
在高光照条件下检测室会发生荧 光闪烁现象，这种单一荧光团的闪烁 可以简单的光物理模型进行解释，荧 光团闪烁的主要来源是系统的交叉三 重态。 如果背景信号来自自发荧光，那 么入射强度的增强不会引起信噪比的 增加。 在开始时，随着如射强度的增加 ，光子计数率呈直线增加，并很快达 到最大值。
四甲基罗丹明标记的脂质分子的光子计数率
F.分子信 标 F.分子马 达
荧光单分子检测的应用领域
分子发光分析
分子发光分析
荧光偏振
单分子荧光分子具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，分 子只吸收偏正方向与其偶极矩方向一致的光子。因此在偏振
激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向
，可以确定单个荧光分子的空间取向。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
影响分子检测能力的因素： 由于样品中杂质产生的背景干扰；
分子发光分析
23.6单分子荧光检测的生化应用
23.6.1单分子酶动力学
用荧光标记的酶分子或底物反应，
在反应过程中会发生酶的构型变化，使 绿色荧光的量子产率增加，引起绿色荧
底物分子
酶分子
光强度的增加；通过检测反应过程中荧
光强度的变化，对酶促反应进行实时监 测，从而获得与酶促反应有关的丰富的
动力学数据。
瞬时增加。
分子发光分析
23.7单分子荧光检测的其他应用
由于单分子检测具有快速、选择性强、纳米级分辨率、检测限 低、可进行实时监测等特点而在生物化学、医学、生命科学物理等 领域得到了广泛的应用。
A. 单分子 荧光寿命估算 H.单分子 传感器 G.偶极辐 射成像 B. 单分子 取向成像
C. 单分子 取向和旋 转运动 D.单分子 共振能量转移 E.时间分辨 单分子研究
单分子荧光检测与荧光相关光谱
分子发光分析
主要内容：
单分子荧 光检测
荧光相关光 谱在单分子 检测中的应 用
荧光相关 光谱
分子发光分析
概述 概 念：
单分子荧光检测是检测灵敏度达到分子水平的一
系列高灵敏检测技术的总称。已经达到了分子检测灵敏
度的极限。它能对单个分子进行检测和成像，而且可以 通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的 途径进行实时监测，能对生物大分子进行探测并提供分 子结构与功能之间的信息。其检测的空间尺度能达到纳
，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子 的特殊位置和行为。
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
滤光器 电感耦合摄像机 更直接 棱镜 物镜 更方便
常用的宽视场检测方法。两种方
法都是基于倒置显微镜。 使用第一种方法是要使入射光瞄
准物镜的焦点。
绿色荧光蛋白图像
分子发光分析
23.3SMD光学装置
另一种限制检测体积的方法是共
焦光学和逐点检测，其所用的是 一种光子探测器（SPAD），其原
光纤
理如右图所示。单点检测器的存
米数量级。
分子发光分析
概述 1.单分子检测的理论意义:
通常对大量分子集合体的观察测量只能反映分子的平均效应，这种
平均效应掩盖了许多特殊的信息；而这些特殊的信息在研究具有非
均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构式显得尤为重要。 体系中各个分子的变化过程与时间密切相关，单分子检测可以对体
系中的单个分子进行研究；单分子的特征对局部场的存在非常敏感
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
和梳状陷波滤波器。
全息陷波滤波器吸收光谱图
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在532nm的激发光下，选用不同的滤光 器检测尼罗红得到的光谱图。陷波滤波 器、长波通滤波器、双色向滤波器。
通过特定的发射滤波器是尼罗红 的荧光强度明显减弱。
分子发光分析
23.5单分子光物理性质的研究
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测 器
SPAD（光子探测器）——单分子单点测量优选检测器，有以下优点： SPAD连同单光子计数电子设备，只需一个5伏的电源即可工作； 量子效率更高，能达到60%~90%； 背景计数率低，能见效背景干扰； CCD（电感耦合检测器）——用于单分子成像 由一个像素阵列构成，每个像素点都是一个独立的检测器；
实现。
单分子的新号要大于背景的干 扰信号，要减少拉曼散射、瑞 利散射及其它杂质荧光造成的 干扰。缩小探测体积能有效减
少背景干扰。
分子发光分析
概述 4.单分子荧光的特征：
量子跳跃
发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的典型特征，
取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光 光谱和荧光强度涨落现象的原因。
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；
提高分子检测能力的方法：
单分子信号与探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
CCD不是光子计数探测器，而是一种集成探测器，每个像素点的信号
正比于入射光子的数量； 像素点的噪音不会随时间二增加，且有较高的量子效率。
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在单分子检测中，除去激发波长处的 散射光的影响是非常必要的。根据原
理的的不同可以分为全息陷波滤波器
配置；
散射光被双色向滤光镜分离出来； 双色向滤光镜是一种能透过一些波
长的光，二反射其他波长的光的装
置。
共聚焦光学检测原理
分子发光分析
23.3SMD光学装置
几乎所有的单分子荧光检测器都 使用光学装置限制观察体积。在 宽视场检测和逐点检测中用到了 不同的方法。在宽视场检测中最 常用的是全内反射，右图是两种