02第2章-原核基因表达及其调控
基因的结构与表达调控
基因结构及其表达的调控第一部分知识拓展一、基因的结构基因是有遗传效应的DNA分子片段；基因的遗传效应是指复制、转录、翻译、调控、突变、重组等功能。
（一）原核细胞的基因结构分为编码区、非编码区。
非编码区由编码区上游和编码区下游的DNA序列组成。
非编码区虽然不能编码蛋白质，但起着调控遗传信息表达的作用。
例如位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
（二）真核基因是不连续基因1、实例：鸡卵清蛋白mRNA与DNA杂交实验鸡卵清蛋白基因的大小和结构如下：（1）A、B、C、D、E、F、G的序列不能转录，约占75.2%(5641bp)（2）L、1、2、3、4、5、6、7的序列能够转录，约占24.8%(1859bp)2、真核基因的结构（1）基因由编码区和非编码区两部分组成（2）基因编码区结构及转录（以不同动物的β-珠蛋白基因为例）二、基因表达的调控（一）原核基因表达的调控1、大肠杆菌在乳糖存在的环境下，乳糖对其代谢基因表达起到诱导作用2、乳糖操纵元的组成3(真核生物基因表达调控的过程与原核生物有许多共同之处。
例如：在真核生物结构基因的侧翼序列上，同样存在着许多不同的调控序列。
真核生物通过特异性蛋白与某些调控序列的结合与否，来调控基因的转录。
但是，真核生物基因表达调控比原核生物复杂得多，有许多方面是原核生物所没有的表现在：1、DNA含量高和基因数目多，且与其他物质组成核小体2、转录和翻译在空间与时间上分开，转录在细胞核中进行，翻译在细胞质中进行。
3、前体RNA需要剪接才能成为有功能的成熟的信使RNA。
4、多细胞生物在个体发育过程中要发生细胞分化，分化是不同基因表达的结果。
不同组织细胞的基因活化或受阻的时空序列不同，发育阶段、激素水平是基因表达调控的主要因素，营养和环境因素则为次要影响因素。
第二部分例题讲解例1、人胰岛细胞能产生胰岛素，但不能产生血红蛋白，据此推测胰岛细胞中A、只有胰岛素基因B、比人受精卵的基因要少C、既有胰岛素基因，也有血红蛋白基因和其他基因D、有胰岛素基因和其他基因，但没有血红蛋白基因[答案]C。
原核、真核生物基因及表达调控
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
《原核生物基因表达调控》练习题及答案
《原核生物基因表达调控》练习题及答案一、名词解释1.基因表达调控答案：所有生物的信息，都是以基因的形式储存在细胞内的DNA（或RNA）分子中，随着个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统，转变成蛋白质或功能RNA分子，执行各种生理生物化学功能。
这个从DNA到蛋白质或功能RNA的过程被称之为基因表达，对这个过程的调节称之为基因表达调控。
2.组成性基因表达答案：是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。
其基因表达产物通常是对生命过程必须的或必不可少的，一般只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，且较少受环境因素的影响及其他机制调节，也称为基本的基因表达。
3.管家基因答案：某些基因产物对生命全过程都是必须的获必不可少的。
这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中均表达，被称为管家基因。
4.诱导表达答案：是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。
5.阻遏表达答案：是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。
6.反式作用因子答案：又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。
它们由某一基因表达后通过与特异的顺式作用元件相互作用，反式激活另一基因的转录。
7.操纵子答案：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。
8.SD序列答案：存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守片段，它与16S rRNA 3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
根据首次识别其功能意义的科学家命名。
9.阻遏蛋白答案：是一类在转录水平对基因表达产生负控作用的蛋白质，在一定条件下与DNA结合，一般具有诱导和阻遏两种类型。
在诱导类型中，信号分子（诱导物）使阻遏蛋白从DNA释放下来；在阻遏类型中，信号分子使阻遏蛋白结合DNA，不管是哪一种情况，只要阻遏蛋白与DNA结合，基因的转录均将被抑制。
原核生物的转录及调控
• 利链菌素（ streptolydigin）：与细菌 RNA pol β亚基结合，抑制转录的延伸。
• 肝素：与细菌RNA pol β’亚基结合，阻 碍其与模板DNA的结合。
第三节 原核生物转录的过程
• RNA的转录包括promotion，elongation，termination 三过程；
TATAAT（pribnow Box）
Initiation site ： +1 site。 RNA transcriptional startpoint （I site） A/G
-35 (R)
-10 (B)
+1 (I) RNA
l Sextama Box与Pribnow Box间距17bp，有利于RNA
2
40000*2
β rpoB
1
155000
β ’ rpoC
1
σ rpoD
1
160000 85000
部位 核心酶 σ因子
可能功能
多样 结合核苷酸 结合模板 起始识别因子
RNA polymerase in prok.
βα σ
α β’
Core Enzyme for elongation 依靠静电作用力 非专一性与非特异DNA 结合 半衰期；60’
βα
σ
α β’ cover 60bp
Holo Enzyme for initiation 依靠空间结构 专一性与 特异DNA结合
半衰期；数小时
Cartoon illustrating separation of the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS-PAGE
原核基因表达及其调控概要
质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然 有很强的复制起始的功能。
电泳后回收片段c
电泳后回收片段1和3 连接
温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响
由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起 始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的 pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。
Ptac 启动子：
是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强 得多，是一组强启动子。包括：
（1） PtacI：PlacUV5的-10区 ＋ Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在
内的46bp的DNA） ＋ Plac的操纵基因； （3） Ptac12：Plac的-10区 ＋Ptrp的-35区
trp promoter色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可 形成启动子-阻遏蛋白复合物。
trp 启动子的脱阻遏可通过：
（1）移除色氨酸； （2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid）. 3’--吲哚丙烯酸
trpR 阻遏蛋白 Trp
色氨酸操纵子（trp operon）
第二章 原核微生物的基因表达与操作
2.1 原核微生物的基因表达及其调控 2.2 原核微生物的基因表达产物的分离纯 化
第一节 原核生物的基因表达与调控因素
（1）转录因素； （2）翻译因素； （3）蛋白质的稳定性； （4）胞外分泌的特性
一、原核生物的基因表达
（一）、转录对基因表达的影响
新生RNA序列与模板链 互补；与编码链相同。
（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下 游加入了-半乳糖苷酶的 编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点；
基因表达的调控机理和方法
1.乳糖操纵子的调控机理（可诱导的操纵子）
（1）人们早在上个世纪初就发现了酵母中酶的诱导现象。即分解 底物的酶只有底物存在时才出现。酶受底物的诱导，这种可诱导现 象在细菌中普遍存在。
在培养基中加入适合底物-乳糖或半乳糖后2~3分钟，β一半乳 糖苷酶可迅速达到5000个酶分子，增加了1000倍，占细菌蛋白总量 的5~10%。 (β一半乳糖苷酶水解乳糖→半乳糖+葡萄糖 2个单糖)。
基因表达及其调控的特点
组成性基因表达（constitutive gene
expression）管家基因的表达方式，较
少受环境影响，在个体各生长阶段的几 乎全部组织中持续表达或变化很小。
管家基因（housekeeping gene）在一个
生物个体的几乎所有细胞中持续表达的 基因。
诱导表达（induction expression）有一些基
5、倒位蛋白通过DNA重组倒位而调节基因表达 倒位蛋白是一种位点特异性的重组酶。
6、衰减子
衰减子又称为弱化子，位于一些操纵子中第一个结构 基因之前，是一段能减弱转录作用的序列。如色氨酸 操纵子序列内含有一段衰减子序列.
7、RNA聚合酶抑制物 细菌在缺乏氨基酸的环境中，RNA聚合酶活性降低， RNA（rRNA,tRNA）合成减少或停止，这种现象称为严 谨反应。机制：当氨基酸缺乏时，游离核糖体与空载的 tRNA增加，在ATP存在下，产生pppGpp和ppGpp， 后者与RNA聚合酶结合形成复合物，进而使RNA聚合酶 构象变化，活性降低。
启动子功能：： （1）决定转录方向及那一条DNA链作模板。（以信 息链的互补链作模板，转录mRNA与信息链一致）
（2）决定转录效率。 E.coli启动子，在-35、－10的 两个区序列称为一致性序列。通过比较大量的E.coli启 动子，表明这两个序列中各碱基的出现频率为-35区： TGACA；-10区：TATAAT。如果某一个启动子与上 述序列越接近，基因的转录效率越强。反之就弱。
原核生物基因表达调控概述
原核生物基因表达调控概述基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。
1.基因表达调控意义在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。
2.原核基因表达调控特点原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。
这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。
调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。
细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。
细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。
（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。
这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。
二.原核生物表达调控的概念（1）细菌细胞对营养的适应细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。
这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。
而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。
（2）顺式作用元件和反式作用元件基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。
反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。
RNA聚合酶是典型的反式作用因子。
基因的表达与调控
No RNA
R-
1 No RNA R-
No RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
No RNA
No RNA
1
21
2
2
32
3
3、基因的微细结构
20世纪50年代的生化技术还无法进行DNA的序列 测定，本泽尔利用经典的噬菌体突变和重组技术， 对T4噬菌体rⅡ区基因的微细结构进行了详细分析。
野生型T4噬菌体 可侵染B株和K12株 噬菌斑小而模糊
功能上被互补（顺反）测验所规定的核苷酸 序列。
假定有两个独立起源的隐性突变，如a1与a2，它 们具有类似的表型。
如何判断它们是属于同 一个基因的突变，还是分 别属于两个基因的突变？ 即如何测知它们是否是等 位基因？
二、基因的微细结构
1、互补作用与互补测验(顺反测验)
需要建立一个双突变杂合二倍体，测定这两个突 变间有无互补皱粒表现型是由于缺少了淀粉档分享dnagtacatcatgtacttgaaacttgacctggagaacttgaacttaaatttmrna密码子guacaucuuacuccugaagaaaaa氨基酸dnagtacatmrna密码子gua氨基酸dnaaaatttmmrna密码根据红色面包霉的研究提出了一个基因一个酶的假说后来又被修改为一个基因种多肽链
Enzymes
B
CAP
G
R
ZY A
a
b
P
X
在有葡萄糖存在时，不能形成cAmp，也就不能 形成正调控因子cAmp-CAP，因此，基因不表达。
目前，通过遗传分析证明了lac操纵元的存在； 已经分离出阻遏蛋白，并成功地测定了阻遏蛋白 的结晶结构，以及阻遏蛋白与诱导物及操纵子序 列结合的结构。