蛋白质电泳分析

3 电泳技术分类
4．染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5 分钟，再转入漂洗液中反复浸洗3～4次，直至背景颜色脱净为 止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至 点样处的方向分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球 蛋白及γ-球蛋白。 5．定量测定：时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开， 分别浸在体积 0.4mol/L氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的 无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜 条放入透明液中浸泡2～3分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干 燥后，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。
5.2.2 影响迁移率的外在因素
1 电场强度:电场强度是指单位长度（每一厘米）支持物体 上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。当电压 在500V以下，电场强度在 2-10v/cm 时为常压电泳。电压 在 500V 以上，电场强度在20-200V/cm 时为高压电泳。 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快
5.2 影响迁移率的外在因素
4 温度的影响 ：电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电 泳有很大的影响。温度每升高1℃，迁移率约增加2.4%。 为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置
5 支持物的影响 ：对支持物的要求一般是均匀和吸附力小 ，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫 描图谱无法重复。
• 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持 介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技 术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。
1 电泳技术发展简史
• 30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物 学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分 辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标 准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行 分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。
6 电渗：电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电 渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔 ，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子 或负离子，使溶液相对带负电或正电。应尽可能选择低电 渗作用的支持物以减少电渗的影响。
6 常用的电泳方法
6.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 6.2 琼脂糖粘胶电泳 6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.4 等电聚焦电泳 6.5 双向电泳 6.6 免疫电泳 6.7 DNA序列测定
蛋白质电泳与分析
Protein electrophoresis analysis
目录
• 1 电泳技术发展简史 • 2 电泳的基本原理 • 3 电泳技术分类 • 4 电泳技术的应用 • 5 影响电泳迁移率的因素 • 6 常用的电泳方法 • 7 电泳仪器
1 电泳技术发展简史
• 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘 土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻 璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极 移动，这就是电泳现象。
• 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化 分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视
2 电泳的基本原理
• 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多 重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核 酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带 正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在 电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及 分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同 的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
3 电泳技术分类
二 实验材料、仪器及试剂 1．材料：健康人血清或鸡血清 2．仪器：电泳仪 电泳槽 3．试剂： （1）醋酸纤维素薄膜； （2）pH8.6 巴比妥缓冲液（离子强度0.06～0.07）：取巴比 妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至5 00ml。 （3）染色液：取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中，再加 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。 （4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水50ml混合。 （5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合
3 电泳技术分类巴比 妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。 2．点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄 膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样 品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边 缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血 清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置 电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。 3．电泳：打开电源，调节电压 110～130V，电流0.4～0.6m A/cm宽，电泳时间45～60分钟，电泳完毕后，关闭电源。
6 常用的电泳方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate pol yacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE） 作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。
作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺 凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过 程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量 大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分 开。
4 电泳技术的应用
• 电泳技术主要分离各种有机物和无机盐；也可用于分析某种物 质纯度；还可用于分子量测定。
• 电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质的 分析，“指纹法”就是电泳与层析法的结合产物。用免疫原理 测试电泳结果，可提高对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术 结合发现了同工酶，从而对酶的催化和调节功能有了更深入的 了解。所以电泳技术在医用科学中是一项重要的技术。
5 影响电泳迁移率的因素
5.1 迁移率: 是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。
5.2 迁移率的影响因素: 内在因素 外在因素
5.2.1 影响迁移率的内在因素
① 所带静电荷的多少——迁移率与表面电荷成正比。
② 大小和形状——直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快 。
③ DNA构象——一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
正极
带负电粒子 带正电粒子
负极
3 电泳技术分类
3.1 区带电泳 3.2 界面电泳 3.3 等速电泳 3.4 等点聚集电泳 3.5 毛细管电泳
3 电泳技术分类
一 原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电 泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反 的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定 的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中， 则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移 动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、 分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋 白质分离开来。
1 电泳技术发展简史
• 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质 的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。
• 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了 各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各 种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为 支持介质的区带电泳方法
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白 质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样 品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后， 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（ 可以忽略电荷因素）。
6 常用的电泳方法
6.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 6.2 琼脂糖粘胶电泳 6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.4 等电聚焦电泳 6.5 双向电泳 6.6 免疫电泳 6.7 DNA序列测定
7 电泳仪器
2 溶液的pH值 ：溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质 点的带电性质及所带净电荷量。溶液的pH离pl越远，质点 所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根 据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。
3 溶液的离子强度：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降 低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周 围，相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmo sphere），它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该 粒子的迁移率。
• 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳 。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢 酶的电泳移动和等电点。
• 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进， 创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳 方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组 成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获 得了1948年的诺贝尔化学奖。
6 常用的电泳方法
6.1 纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 6.2 琼脂糖粘胶电泳 6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.4 等电聚焦电泳 6.5 双向电泳 6.6 免疫电泳 6.7 DNA序列测定
• 7.1电泳槽
圆 盘 电 泳 槽
7 电泳仪器
垂直平板电 泳槽
水平电泳 槽
转移电泳槽
• 电源
• 辅助设备 （1）外循环恒温系统 （2）凝胶干燥仪 （3）凝胶扫描仪