SDS-PAGE电泳分析表达蛋白
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量一、药剂准备a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml3、10%SDS 5ml4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。
可可5、TEMED 0.5 ml6、1M Tris-HCL,PH6.8 15mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml，1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（1L）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。
（不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：甲醇或者乙醇乙酸250ml 80ml去离子水补至 1000ml,混匀，备用。
二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE 分析操作过程：1、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。
确保质量分数为3～5g/L。
试管依次标号1、2、3、4、5。
用保鲜膜和皮筋封口保存备用。
最好当天现配。
2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。
按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。
依照15%胶，5ml（打勾）一栏。
如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。
a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。
b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。
蛋白质的SDS-PAGE检测
百泰派克生物科技
蛋白质的SDS-PAGE检测
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）十
二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化技术，它利用十二烷基硫酸钠消除蛋白质结构和电泳的影响，使蛋白质仅根据分子质量差异进行分离，广泛用于蛋白质的分离、纯度鉴定、分子量鉴定以及表达分析等。
蛋白质SDS-PAGE检测包括蛋白质SDS-PAGE电泳和电泳后凝胶图像分析两个部分。
在蛋白质SDS-PAGE电泳过程中，不同分子质量的蛋白质迁移速率不同，相对分子
质量较大的蛋白质在电场的作用下迁移较慢，电泳结束后仍然靠近点样孔；而低分子质量的蛋白质迁移速率较快，电泳结束后处于离点样孔较远的位置。
经银染或考马斯亮蓝等方法染色后，便可以观察到凝胶上蛋白质条带的大小、数量和分布情况。
百泰派克生物科技采用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供快速高效的蛋白质SDS-PAGE检测服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子
量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-PAGE全细胞蛋白电泳
2.2.5 SDS全细胞蛋白电泳提取蛋白质：用Ependorf管离心收集菌体（对数生长期），称其重量，并用样品缓冲液（sample buffer）裂解细胞，使其浓度达到150 mg⋅ml-1，放入-20℃冰箱中，临用前在95℃下加热10 min，并以4000 rpm/min离心2 min，待用。
电泳：用DYCZ-24D双垂直电泳槽，10%的分离胶，5%的浓缩胶。
先灌分离胶，等其凝固后再灌入浓缩胶，同时插好梳子。
电泳前将2.1.2.5中样品取出溶化后在95℃下加热10 min放在冰上冷却后即可点样，第一个孔点buffer，第二个孔点marker，其余每孔点样7 μl，电泳时恒流30 mA，视其指示剂溴酚兰到达胶的底端为止。
胶的染脱色及判读：电泳完把胶取下放在大小适合的盒子里，放入染色液在37℃摇床振荡30 min，然后用脱色液脱色，遵循少量多次原则（约5次），直到背景蓝色褪去。
把胶放在紫外成像仪上照相观察，把条带相同的归为一类。
所需试剂：样品缓冲液：4 ml 水；1 ml 0.625 M Tris-HCl，pH 6.8；0.8 ml 甘油；1.6 ml 10% SDS；0.4 ml β-巯基乙醇；0.2 ml 1%百里溴酚兰。
电泳缓冲液：3.03 g Tris base，14.41 g 甘氨酸，1 g SDS；加水到1000 ml；pH 8.4+0.1。
下胶缓冲液：18.17 g Tris Base，2 ml 20%SDS溶液，pH 8.8，加水到100 ml。
上胶缓冲液：6.06 g Tris Base(1.5 M), 2 ml 20%SDS溶液，pH 6.8，加水到100 ml。
10ml 10% 分离胶：2.5 ml 下胶缓冲液；3.4 ml H2O；4.1 ml Acry/biscrylamide (24.2%, 30:1) ; 30 μl 10%的过硫酸铵; 20 μl TEMED。
5 ml5% 浓缩胶：1.25 ml 上胶缓冲液; 2.25 ml 水; 1 ml Acry/biscrylamide(24.2%); 30 μl 10% 的过硫酸铵; 20 μl TEMED。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
蛋白SDS-PAGE蛋白范围
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蛋白SDS-PAGE蛋白范围
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE），也称之为变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种含有十二烷基硫酸钠（SDS，变性剂）的常用电泳技术，常用于检测蛋白质分子量大小和样品中的蛋白纯度。
SDS-PAGE有效分离蛋白的范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其分子筛孔径
随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比率的增加而减小。
因此，SDS-PAGE蛋白范围主要取
决于丙烯酰胺的浓度（%）。
通常情况下，丙烯酰胺的浓度为15%、12.5%、10%、
7.5%、5.0%时，SDS-PAGE蛋白范围分别为15-43.5kDa、15-60kDa、18-75kDa、30-120kDa、60-212kDa。
因此，在进行蛋白SDS-PAGE检测之前，需要预估目标蛋白的分子量大小，然后通过SDS-PAGE实验进行验证。
若无法预知目标蛋白分子量大小，则可优先选择蛋白分子量检测范围大的丙烯酰胺浓度开展SDS-PAGE实验，然后将
电泳后的凝胶蛋白条带采用凝胶呈像系统软件计算蛋白分子量和纯度。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE的蛋白分离服务，经过SDS-PAGE电泳将获取蛋白质样品的电泳图谱，结合其它基于质谱的蛋白质鉴定服务对样品进行分析或纯化，用于复杂生物样品的蛋白质谱分析。
您只需将实验目的告知并将样品寄出，我们将负责项目后续所有事宜，包括样品净化（去除DNA和RNA，减少s-s键，蛋白质）、消除样品中高丰度蛋白质以及蛋白质提取、纯化、浓缩和水解消化等处理。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
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试验三SDS-PAGE电泳分析表达蛋白
一、实验目的与要求
1. 掌握SDS-PAGE电泳的操作步骤。
2. 学会用电泳图分析原核表达效果
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小。
三、实验材料与试剂
诱导表达后的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳试剂，蛋白上样缓冲液等。
四、实验仪器设备
伯乐蛋白电泳仪，细菌振荡培养箱、高压灭菌锅、电子天平，电炉，量筒等。
五、实验步骤
1、SDS-PAGE凝胶电泳试剂
1）1.0 M Tris/HCl溶液（pH 6.8）：121 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至6.8，定容至1 L；
2）1.5 M Tris/HCl溶液（pH 8.8）：182 g Tris溶于900 mL蒸馏水，浓HCl调pH至8.8，定容至1 L；
3）30 %丙烯酰胺溶液：292 g丙烯酰胺和8 g甲叉双丙烯酰胺溶于900 mL蒸馏水中，定容至1 L，4 ℃避光贮存待用；
4）5×电泳缓冲液（pH 8.3）：94 g 甘氨酸和15.1 g Tris溶于800 mL蒸馏水中后，加入50 mL 10 % SDS溶液，定容至1 L，常温贮存，用时用蒸馏水稀释至1倍缓冲液；
5）上样缓冲液：4 mL 10 % SDS溶液，0.2 mL巯基乙醇，1 mL 1.0 M Tris缓冲液，然后加入2 g甘油，20 mg溴酚蓝，充分溶解后定容到20 mL，4 ℃贮存待用；
6）染色液：1.0 g 考马斯亮蓝（R250），100 mL冰醋酸，450 mL 甲醇混合，定容至1 L，充分混匀备用；
7）脱色液：乙酸100 mL，甲醇300 mL，加水定容到1 L；
8）10 %过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵加入1 mL 蒸馏水充分溶解，需现配现用。
2、SDS-PAGE凝胶电泳试剂
1）利用12 %的分离胶进行SDS-PAGE进行电泳
2）配制12 %的分离胶（10 mL）
混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入分离胶溶液，留出浓缩胶的空间（与顶部距离约2.5 cm），以无水乙醇封胶，室温放置使其完全聚合（约30 min）。
4）倒掉无水乙醇，超净工作台放置10-15 min，使其完全挥发；
5）5 %浓缩胶配制（10 mL）
混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入浓缩胶溶液至顶端，小心插入梳子，室温放置使其完全聚合（约30 min）。
6）聚合完全后，轻轻拔出梳子，放入电泳设备，准备点样；
7）点样：用点样10 μL枪头进行点样，每次点20 μL；
8）电泳：额定电压80 V 30-60 min，待溴酚蓝条带离开浓缩胶时调整额定电压为120 V 至电泳结束；
9）染色及脱色：SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶，用去离子水清洗3-4遍，加入染色液染色2-3 h（30 r/min），倒掉染色液，用去离子水漂洗3-4遍，加入脱水液脱色6-8 h；
10）成像：脱色结束后用Bio-rad成像系统成像拍照并保存图片。
六、实验作业
1、简述SDS-PAGE操作原理。
2、简述SDS-PAGE操作步骤。
3、何谓聚丙烯酰胺凝胶电泳？
4、何谓电泳及其分离原理？
5、SDS-PAGE的应用有哪些？
6、电泳蛋白样品如何制备？。