染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究
染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究基因组是生物遗传信息的载体。基因组的稳定性对于生物个体以及种族的生存与延续都具有至关重要的作用。
然而生物体内的基因组DNA并不是处于一个绝对安全的环境下,细胞内的自身代谢产物以及细胞外的各种毒性因子的刺激都会造成DNA损伤。损伤的DNA
如果不能被及时修复或错误修复就会导致基因突变或缺失,进而危害生物体。
为了维持遗传信息的稳定性,真核生物的DNA通过与组蛋白结合进化出复杂紧密的染色质结构。这种致密的结构虽然可以保护整个基因组尽可能免受内外界刺激因子的影响,但同时,这种结构对于DNA的转录,复制和修复等代谢活动却是一个巨大的障碍。
因此,染色质结构的动态变化在DNA代谢中扮演着重要的角色。DNA双链断
裂(DSBs)是一种严重的致死的DNA损伤类型。
生物体为了应对体内的DNA损伤进化出复杂有序的修复机制,以此来维持机体正常的生命代谢活动。在DNA损伤修复过程中涉及许多蛋白的共同参与,其中包括细胞周期调控蛋白、骨架调节蛋白、DNA损伤修复蛋白、染色质结构调控蛋白等。
BRG1是染色质改构复合物SWI/SNF的核心催化亚基,具有ATP水解酶的活性。已有研究发现,BRG1与肿瘤发生和基因组不稳定性具有紧密联系。
然而,BRG1在DNA双链断裂修复中的作用机制仍不是很明了。本文利用化疗药物依托泊苷(etoposide),博来霉素和紫外激光照射等手段,在体外构建了DNA
双链断裂损伤修复模型。
通过SW13和U2OS细胞存活率实验,我们发现BRG1缺失会明显增加细胞对
DNA损伤药物的敏感性,同时降低受损细胞的生存能力。另外,细胞彗星电泳与免疫荧光实验共同证明了,BRG1对于DNA双链断裂的修复进程具有至关重要的作用。
接下来,我们通过染色质分离提取与染色质免疫共沉淀技术发现,BRG1能够
被募集到DNA损伤位点。真核生物中DNA双链断裂主要有两种修复途径:同源重组修复和非同源重组末端连接修复。
利用DR-GFP与EJ5-GFP报告系统,我们进一步探讨了BRG1参与DNA双链断裂修复的机制。通过流式细胞仪检测DR-GFP与EJ5-GFP报告系统的GFP阳性细胞的比例,我们发现BRG1主要参与同源重组修复途径而不是非同源重组末端连
接修复。
最后,利用免疫荧光,免疫共沉淀以及活细胞示踪观察实验,我们发现BRG1
能够与介导RAD51和RPA替换的RAD52蛋白相互作用,并且调控RAD52在损伤位点的募集,从而调节RPA与RAD51在单链DNA(ssDNA)上的置换过程,进而影响同
源链侵入过程的起始。本文研究揭示了染色质改构因子BRG1参与DNA双链断裂修复的作用机制,为阐明染色质结构与DNA代谢的关系提供了一定的证据。
蛋白质相互作用的研究方法
举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究
染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究基因组是生物遗传信息的载体。基因组的稳定性对于生物个体以及种族的生存与延续都具有至关重要的作用。 然而生物体内的基因组DNA并不是处于一个绝对安全的环境下,细胞内的自身代谢产物以及细胞外的各种毒性因子的刺激都会造成DNA损伤。损伤的DNA 如果不能被及时修复或错误修复就会导致基因突变或缺失,进而危害生物体。 为了维持遗传信息的稳定性,真核生物的DNA通过与组蛋白结合进化出复杂紧密的染色质结构。这种致密的结构虽然可以保护整个基因组尽可能免受内外界刺激因子的影响,但同时,这种结构对于DNA的转录,复制和修复等代谢活动却是一个巨大的障碍。 因此,染色质结构的动态变化在DNA代谢中扮演着重要的角色。DNA双链断 裂(DSBs)是一种严重的致死的DNA损伤类型。 生物体为了应对体内的DNA损伤进化出复杂有序的修复机制,以此来维持机体正常的生命代谢活动。在DNA损伤修复过程中涉及许多蛋白的共同参与,其中包括细胞周期调控蛋白、骨架调节蛋白、DNA损伤修复蛋白、染色质结构调控蛋白等。 BRG1是染色质改构复合物SWI/SNF的核心催化亚基,具有ATP水解酶的活性。已有研究发现,BRG1与肿瘤发生和基因组不稳定性具有紧密联系。 然而,BRG1在DNA双链断裂修复中的作用机制仍不是很明了。本文利用化疗药物依托泊苷(etoposide),博来霉素和紫外激光照射等手段,在体外构建了DNA 双链断裂损伤修复模型。 通过SW13和U2OS细胞存活率实验,我们发现BRG1缺失会明显增加细胞对
DNA损伤药物的敏感性,同时降低受损细胞的生存能力。另外,细胞彗星电泳与免疫荧光实验共同证明了,BRG1对于DNA双链断裂的修复进程具有至关重要的作用。 接下来,我们通过染色质分离提取与染色质免疫共沉淀技术发现,BRG1能够 被募集到DNA损伤位点。真核生物中DNA双链断裂主要有两种修复途径:同源重组修复和非同源重组末端连接修复。 利用DR-GFP与EJ5-GFP报告系统,我们进一步探讨了BRG1参与DNA双链断裂修复的机制。通过流式细胞仪检测DR-GFP与EJ5-GFP报告系统的GFP阳性细胞的比例,我们发现BRG1主要参与同源重组修复途径而不是非同源重组末端连 接修复。 最后,利用免疫荧光,免疫共沉淀以及活细胞示踪观察实验,我们发现BRG1 能够与介导RAD51和RPA替换的RAD52蛋白相互作用,并且调控RAD52在损伤位点的募集,从而调节RPA与RAD51在单链DNA(ssDNA)上的置换过程,进而影响同 源链侵入过程的起始。本文研究揭示了染色质改构因子BRG1参与DNA双链断裂修复的作用机制,为阐明染色质结构与DNA代谢的关系提供了一定的证据。
聚焦DNA双链断裂(DSBs)
最近，有关DNA双链断裂（DSBs）研究成果相继发表在顶级期刊Nature杂志子刊上。首先科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂（DSBs）作图新方法，相关研究成果荣登Nature Method杂志。于此同时，Nature杂志另一子刊Nature Neuroscience也刊登了一项成果，讲述了引发DNA双链断裂的因素。 Nature.Med：全基因组DSB作图新方法 近日，科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂(DSBs)作图新方法，这种作图法以单核苷酸为基本单位，称之为BLESS(direct in situ breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing)，相关研究论文于2013年3月20日在线发表在Nature Method杂志上。 此项研究由德国法兰克福歌德大学医学院生物化学研究所 II、美国得克萨斯医学科大学转化科学研究院等处研究人员共同完成。 研究人员利用人类和小鼠细胞以及不同的DNA双链断裂(DSBs)诱导因子和测序平台对BLESS法进行验证。BLESS能够识别端粒末端、SCE核酸内切酶诱导的DNA双链断裂以及复杂的DSB全基因组。作为一种原理证明，我们让人类细胞复制压以敏感性基因组为特点，确定了> 2,000非均匀分布的阿非迪霉素敏感区(ASRS)，它们中基因过多，富含微卫星重复序列。人类癌症重排区也富含ASRS，许多癌症相关的基因对复制压具有极高的敏感性。 研究人员称，这种新方法适合各种细胞核实验条件下DSBs全基因组作图，其特异性和分辨率是现在的技术无法实现的。 罗格斯大学的神经遗传学家 Karl Herrup表示，这项工作令人惊叹。DNA 损伤对神经元的伤害极其危险。它无可更换，细胞必须从这些断裂中获取某些有价值的物质。Herrup并未参与此项研究。 加州大学神经科医生 Lennart Mucke，在他研究改变阿尔茨海默氏病(AD)基因组稳定性，偶然发现这种逮捕概念：切断和修复DNA是正常大脑活动的一部分。AD特征?是淀粉样蛋白和受损的神经元DNA纠结成块。带着期望了解更多有关DNA损伤及其相关高水平的淀粉样蛋白，Mucke的团队将研究焦点放在双链DNA断裂上，这是神经科学家认为最严重的损伤形式。 此研究小组揭示了一种自然行为，如探索一种新环境，能引起野生型年轻成年小鼠DNA双链断裂(DSBs)。DNA双链断裂(DSBs)发生在多个脑区域，但在海马齿状回神经最丰富。海马齿状回神经参与学习和记忆，能在24小时内修复。感受器或光刺激下增加的神经元活动，增加了相关神经元DNA双链断裂(DSBs)，而非不相关的神经网络。 人淀粉样前体蛋白(hAPP)转基因小鼠增加了基线神经元DNA双链断裂(DSBs)，且在探索新环境后出现严重和长期的DSBs。其中hAPP可刺激AD关键方面。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统
蛋白质相互作用
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展
DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展 卞广兴 郭葆玉 第二军医大学药学院生化药学教研室(上海,200433) 摘要 双链断裂(doub le strand b reak s,D SB s)是细胞染色体复制过程中经常出现的DNA损伤,它的修复过程在真核生物中以同源重组(homo logy recom b inati on,HR)修复为主。正常机体中有着一系列的基因和蛋白及时修复这些损伤,这些蛋白归属于RAD52上位性集团(RAD52ep istasis group)。它们对细胞发挥功能和维持生存意义重大,近来国外研究十分活跃。 关键词 同源重组;双链断裂 1 与HR有关的基因和蛋白 在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义。它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件。生物体基因组暴露于离子射线或者受内切酶作用,特别是在染色体自我复制过程中都会出现双链断裂。如果这些断裂未能及时修复就会引起细胞的染色体丢失或导致细胞的死亡。修复不正确也会引起基因的突变和染色体的重组。真核生物对这些断裂的修复有两种机理:非同源末端连接(non2 hom o logy end j o in ing,N H EJ)和同源重组(hom o l2 ogy recom b inati on,HR)。 同源重组是发生在DNA的同源序列之间的重组方式。真核生物非姊妹染色子体的交换,姊妹染色子体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导,接合,噬菌体的重组等都属于这一类型。有人认为,在原核生物中D SB s的修复以HR方式为主;而对于真核生物,其它的修复方式才是主要的。但近几年对酵母和哺乳动物细胞的研究发现,真核生物中的HR不仅在机理上与原核相似,而且具有同等的重要性[1]。 在HR中起重要作用的蛋白归属于R ec A家族,其中R ec A是其中的第一个成员,它是一个由R ec A基因编码的蛋白,在E.coli的HR和DNA复制中起重要作用。近几年来,研究发现了R ec A的很多同源蛋白,如T4噬菌体中的U vsX和哺乳动物细胞中的R ad51等。它们被统称为RAD52上位性集团。包括:RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、M R E11和XR S2、XRCC2等。它们的突变缺失细胞都表现出对离子射线的敏感和有丝分裂 无丝分裂缺陷,表明它们是D SB s修复的某条途径的组成部分[2]。其中的不少成员就是在研究射线照射对生物体的作用(radiati on sen si2 tive m u tati on)中发现的,其命名也沿袭了原来的名称(RAD)。从酵母到脊椎动物基因序列的高度保守性表明它们在HR中有着类似的功能。研究中,符合这两者的因子大都可归于RAD52上位性集团。这其中最重要的是RAD51、RAD52和RAD54。 RAD51在所有的细胞中都表达,可能执行链交换的功能。它的作用同R ec A相似,但又不完全相同。Sonoda等[3]把人的RAD51转入鸡B细胞系的D T40细胞发现,RAD51缺失的细胞静息在细胞周期的G2 M期,累积对细胞有毒害作用的染色体断裂并最终死亡。同时发现大多数可探测到的染色体缺失是异染色质型的缺口或断裂,同一染色体的姊妹染色单体在同样的基因座断裂。这表明很多不可修复的裂隙是复制过程中产生的双链断裂的可能原因。尽管RAD51的分布远比其它因子广泛,研究表明它并不是D SB s诱导的所有重组修复形式中应用最广的因子[4]。RAD51在D SB s诱导的同源染色体交换中是必须的,但它对于其他形式的重组,如自发重组(spon taneou s recom b inati on),却并不是必须的。不过,RAD52在已知的这些重组形式中却都是必须的。 RAD52是重组中最重要的蛋白,它在真核细胞中进化保守,原核中基因序列差别较大。R ad52在体内形成多聚体的环,既可以连接DNA链末端又可促进互补链的退火。人的R ad52具有类似的特性。细胞在缺失RAD52的情况下几乎所有形式的HR 都被阻断了[4]。但是研究发现,剔除了RAD52的脊椎动物细胞可以存活而不会象剔除了RAD51等那样严重(死亡),有人认为这可能是细胞中还有其它起类似作用的因子未被发现[5]。 RAD55和RAD57同RAD51具有某些同源
蛋白相互作用-ThermoFisher
Thermo Scientific Pierce Th S i tifi Pi
蛋 蛋白相互作用的研究方法和实践 实
罗 莎 Rosa Luo Ph.D. Application Scientist Biosciences Division Thermo Fisher Scientific China
酵母蛋白质相互作用图谱
Thick blue lines represent literature-derived interactions from PreBIND+MIPS in the HMS-PCI dataset. Thin orange lines represent potential novel interactions. Courtesy MDS Proteomics
2
蛋白质相互作用技术
Genetic Two Hybrid Phage Display Mutational analysis M t ti l l i Biochemical Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (C IP) C I i it ti (Co-IP) Pull-Down Assays Far Western FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Chemical Crosslinking Label-transfer FeBABE F BABE mapping i Fluorescent Immunofluorescence colocalization
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SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)
SCGE法检测DNA损伤 SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性） SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。 若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。 1. 仪器及试剂 冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。 不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。 2. 方法 1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理： 1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。 a.枸椽酸钠抗凝:有2Na 3C 6 H 5 O 7 。和2Na 3 C 6 H 5 ·11H2O等多种晶体。通常用前者配成 109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。 b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu.
蛋白质相互作用数据库和分析方法
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.360docs.net/doc/1816808054.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
蛋白质-蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
蛋白质相互作用的主要研究方法
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是和其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，和抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体和其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术
研究蛋白质的相互作用的方法
研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术
第十一章 蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)
第十一章蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions) 1. 概况 随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。下面以Wnt 信号通路为例对此加以说明。 Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲(frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、β-联蛋白(β-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋白、淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF) 等。当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，β-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的β-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。 从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面： ⑴多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠 杆菌DNA合成复合酶等。 ⑵多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。 ⑶瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。 这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。 除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。 2. 蛋白质相互作用的研究策略与方法 2.1生化方法 2.1.1蛋白质亲和层析 ⑴方法 在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖(Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后，用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS 洗脱下结合在柱上的蛋白质。有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。 ⑵蛋白质的纯化方法 获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)，可以在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。其他的还有staphylococcus蛋白A可在含IgG的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。