CNPY2在胃癌中的表达及其与侵袭转移、微血管密度的关系

CNPY2在胃癌中的表达及其与侵袭转移、微血管密度的关系目的：研究新型的分泌型促血管生成因子CNPY2在胃癌组织中的表达情况，分析其表达与侵袭、转移及微血管密度之间的关系。

方法：收集山西医科大学第一医院手术切除的胃癌组织及癌旁组织标本50例，采用western-blot检测CNPY2的表达情况，免疫组织化学CD34染色计数微血管密度，分析CNPY2的表达与患者临床病理特征及微血管密度之间的关系。

结果：与癌旁组织相比，胃癌组织中CNPY2的表达显著增高（P＜0.05）；CNPY2在有淋巴结转移肿瘤组织中的表达高于无淋巴结转移（P＜0.05），CNPY2在Ⅲ期+Ⅳ期肿瘤组织中的表达高于Ⅰ期+Ⅱ期（P＜0.05）；CNPY2高表达的胃癌组织中肿瘤微血管密度显著增高（P＜0.05）；与肿瘤原发灶相比，CNPY2在转移性淋巴结组织中的表达显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论：CNPY2在胃癌组织中表达上调，可能在胃癌血管生成、侵袭转移中发挥重要作用。

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，根据流行病学统计显示，在我国胃癌的发病率及死亡率仅次于肺癌，居于第二位[1]。

虽然以外科治疗为主的综合治疗取得了一定的进展，但总体而言胃癌的预后不良[2]。

肿瘤的生长、侵袭、转移都依赖于肿瘤新生血管的生成[3-4]，CNPY2是一种新型胞浆分泌型蛋白，其生理作用主要是参与血管平滑肌细胞的生成和迁移、神经突的生长[5-6]，在缺氧状态下CNPY2可诱导血管生成，被认为是一种分泌型血管生长因子[7-8]。

据报道，CNPY2可能通过血管生成作用参与肿瘤的侵袭与进展[9-10]，本研究定量分析了胃癌组织中CNPY2的表达情况及其与微血管密度之间的关系，为胃癌的研究提供新的思路和试验依据，现将试验结果整理报道如下。

1 资料与方法1.1 一般资料标本来源于山西医科大学第一医院普外科2016年5月-2017年5月手术切除的胃癌组织，在不影响病理诊断的前提下留存癌组织及癌旁组织标本，临床可疑转移的淋巴结组织术中行冰冻切片检查，如可见癌转移，则留取少许淋巴结组织，所有标本立即置于-80 ℃低温冰箱保存。

入組患者均为初发、散发、无家族史，术前未经任何形式的放、化疗及靶向治疗，术后经常规石蜡切片病理诊断确诊为胃腺癌。

入组患者的临床病例资料：男32例，女18例；年龄44～73岁，平均（55.2±9.9）岁；分化程度：高分化9例，中分化25例，低分化16例；Lauren分型：肠型33例，弥漫型17例；淋巴结转移：未转移27例，转移23例；TNM分期（第八版）：Ⅰ期+Ⅱ期21例，Ⅲ期+Ⅳ期29例。

试验经患者知情同意，伦理审查通过，严格保护患者隐私。

1.2 主要试剂兔源CNPY2一抗，美国proteintech公司；β-actin内参一抗及抗兔二抗，美国santa-cruz公司；CD34一抗，北京中杉金桥生物公司；组织裂解液及BCA蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物公司；蛋白分子量marker，武汉博士德生物公司；硝酸纤维素膜，北京索莱宝生物公司；甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺等其余试剂为国产分析纯产品。

1.3 蛋白印迹实验提取组织总蛋白：电子天平称取组织0.5 g，眼科剪剪碎后加组织裂解液，于冰上匀浆，低温离心取上清液，按照BCA蛋白定量检测试剂盒步骤检测蛋白浓度。

SDS-PAGE凝胶电泳：配制分离胶及浓缩胶，灌胶至玻璃板中，凝固后上样加入蛋白样品及蛋白分子量marker。

加入电泳缓冲液，预电泳30 min，电压60 V。

电泳45 min，电压120 V。

湿转膜：将凝胶及硝酸纤维素膜夹至转膜板中，加入转移缓冲液，转膜25 min，电压100 V。

蛋白封闭：将裁好的膜置于5%蛋白干粉封闭液中，室温轻摇1 h。

显色：CNPY2（1︰1 000）及β-actin（1︰1 000）一抗，4 ℃冰箱过夜反应。

滴加二抗（浓度1︰3 000）中，室温轻摇1 h。

采用ECL电化学发光法显色，成像仪下曝光摄片。

CNPY2的表达量以其与内参β-actin灰度值比值表示。

1.4 微血管密度检测石蜡包埋，4 μm切片至过胶玻片上，免疫组织化学二步法CD34染色，按说明书步骤进行。

CD34阳性表达部位定位于血管内皮细胞胞质。

微血管密度MVD计数方法：两名病理医师在多人共览显微镜下共同计数，首先在低倍镜（40倍）下选择肿瘤浸润生长明显、间质内小血管最丰富的区域作为热点区，在高倍镜（200倍）计数热点区微血管数量。

计数5个视野，取其平均值作为MVD数量[11-12]。

1.5 统计学处理本研究数据采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，组内比较采用配对t检验，重复测量数据采用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 CNPY2在胃癌及癌旁组织中的表达情况蛋白印迹结果显示，CNPY2在21 KDa处出现显影条带（图1），经灰度分析：CNPY2在胃癌组织中的表达为（0.972±0.233），显著高于癌旁组织（0.224±0.093）（t=6.656，P=0.000）。

在胃癌组织中，CNPY2在不同性别、年龄、分化程度及Lauren分型中的表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但在淋巴结转移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌组织中的表达显著高于淋巴结未转移及TNMⅠ期+Ⅱ期（P＜0.05），见表1。

2.2 CNPY2在转移性淋巴结组织及原发灶中的表达CNPY2在转移性淋巴结组织中的相对表达量为（1.507±0.451），与原发灶（0.867±0.168）相比，CNPY2在转移性淋巴结组织中的表达显著增高，差异有统计学意义（t=2.976，P=0.018），见图2。

2.3 CNPY2的表达与MVD之间的关系无论是否形成管腔结构，CD34阳性标记内皮细胞团亦按独立的微血管分别计数，不连通的血管小分支结构也视为另一个微血管，有平滑肌细胞包绕的大血管或者管径大于8个红细胞的血管不视为微血管。

CD34染色结果见图3。

以CNPY2表达的灰度值中位数为分界点，将其分为高表达及低表达组，低表达组胃癌组织MVD平均计数为（22.4±6.5），与低表达组相比，高表达组MVD计数（32.5±8.2）显著增高，差异有统计学意义（t=-2.575，P=0.033）。

3 讨论CNPY2是一种新型的分泌型促血管生成因子，人类CNPY2基因定位于12号染色体。

属于Canopy家族成员（CNPY1、2、3、4）中的一员，其基因编码蛋白分子量约21 KDa，由182个氨基酸组成[13]。

CNPY2在哺乳动物机体各组织器官广泛表达，尤其以胰腺、心脏及肝脏肝表达较高。

Peng等[14]学者使用定量实时聚合酶链反应，免疫印迹和免疫组织化学分析检测结直肠癌细胞系和组织中CNPY2的表达，结果发现CNPY2的表达在肿瘤细胞系和组织中比正常结肠上皮细胞和肿瘤邻近的正常组织中显著增加，并且可作为结直肠癌患者新的有价值的预后指标。

Yan等[15]学者的研究表明：CNPY2敲低阻止肿瘤生长和血管生成并促进细胞凋亡，在HCT116CRC细胞系中CNPY2的敲减可逆地增加p53活性，p53激活增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，减少细胞周期蛋白依赖性激酶2，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，并减少体内和体外的血管生成。

目前，CNPY2在肿瘤中的研究报道较少，在胃癌组织中尚未见相关报道。

本研究蛋白印迹定量分析结果表明，癌旁正常黏膜组织中CNPY2亦有表达，但其在胃癌组织中的相对灰度值显著增高，提示CNPY2在胃癌组织中表达上调。

在胃癌组织中，CNPY2在不同性别、年龄、分化程度及Lauren分型中的表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但在淋巴结转移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌组织中的表达均显著高于淋巴结未转移及TNMⅠ期+Ⅱ期的癌组织，与原发灶相比，CNPY2在转移性淋巴结组织中的相对表达量显著上调，上述结果提示CNPY2的表达可能与肿瘤的侵袭、转移及预后相关。

恶性肿瘤的相对无限生长是血管依赖性的[16]，作为腫瘤基质的重要组分，肿瘤新生血管可视为肿瘤增殖所必需的滋养系统，血管生成速度和密度是肿瘤侵袭、转移的重要恶性表型[17-18]，微血管密度MVD被认为是指血管形成活动的标志[19]。

本研究以胃癌中CNPY2表达的灰度值中位数为分界点，将其分为高表达及低表达组，通过CD34染色计数肿瘤MVD，与低表达组相比，高表达组MVD的计数显著增高，提示CNPY2可能通过肿瘤血管生成参与胃癌发生发展的病理过程。

綜上，CNPY2在胃癌组织中表达上调，可能通过血管生成作用在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用，有望成为胃癌研究的有效预后因子和潜在基因靶点。

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