疟原虫、检查
疟原虫的显微镜检查
疟疾（Malaria）•系世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，危害极大，非洲每年约100万儿童死于疟疾•疟疾主要分布于热带、亚热带各国，我国的华南、华中(特别是云南和海南)•疟原虫属原生动物亚界--顶复门--孢子纲--疟原虫属•寄生人类的疟原虫有：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等•疟原虫通过蚊叮咬而感染人，疟疾的典型临床表现是周期性寒战、发热和出汗•疟疾诊断主要靠外周血涂片检查•用磷酸氯喹及磷酸伯氨喹治疗，对于抗氯喹虫株则宜用青蒿素类药物、或与奎宁、咯萘啶、磺胺多辛和乙胺嘧啶等联合用药疟疾的临床症状临床表现•周期性：冷（1-2h)à热(4-6h) à汗。
实际上发作周期多不典型，尤其是儿童、初发时和进入疟区的初患病例•冷：全身颤拦、皮肤鸡皮样、面色苍白，口唇与指甲发紫等；夏天盖几层棉被也不暖•热：面色绯红、皮肤灼热、体温39-40℃可伴头痛\全身酸痛,小儿或严重成人可发生惊厥、谵亡或昏迷•汗：大汗淋漓、体温急降，乏力•贫血：发作次数越多、病程越长贫血越严重。
•脾肿大、硬化：脾切面颜色变深；大可达脐下；重量可达500至1000g.慢性患者脾纤维化，包膜增厚而变硬原因•发作周期和红内期裂体增殖周期一致。
•疟原虫代谢产物(外源性热原质)和裂殖子、残余和变性血红蛋白、红细胞碎片被吞噬细胞吞食而产生内源性热原质•疟原虫对红细胞的直接破坏•脾巨噬细胞吞噬红细胞•骨髓造血受抑制•免疫病理（正常抗疟抗体+红细胞自身抗体）疟原虫的生活周期生活史中的关注点：1.感染阶段：子孢子2.感染方式：蚊虫叮咬和输血3.致病阶段：红内期原虫4.寄生部位：肝、红细胞5.媒介：蚊(为终宿主）6.诊断阶段：红内期原虫疟疾的实验诊断病原检查:1. 血涂片染色取外周血制成厚、薄血膜，经吉氏或瑞氏液染色镜检2. 采血时间•恶性疟：发作时、查环状体，发作数小时后因晚期滋养体寄生虫的红细胞滞留下皮下脂肪及内脏微血管中，不易查见。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术
血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别 的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重 要部分，血涂片制作和染色的好坏足以影 响检查的结果，必须把握好“三关”。
疟原虫检验技术
一、玻片清洁
玻片清洁。清洁的玻片无油脂，无划痕， 无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落， 薄血膜涂布不均匀。在用手指持玻片时，只 能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表 面，以避免手指上的油污染玻片。
• 6.6 37
63
900
• 6.8 49
51
900
• 7.0 63
37
900
• 7.2 73
27
900
• 7.4 81
19
900
• 在无条件的地方，此时也可用当地的饮用水煮沸过
滤后试染，试染结果如淋巴细胞的胞浆呈兰色红血
球染色不很兰就可使用。
疟原虫检验技术
3.染色步骤：
①固定：用吉氏染液染色须先将薄血膜用甲醇或无水酒精固 定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上， 避免甲醇流至厚血膜，误将其固定，可用蜡笔划一条线， 或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸发干后即可染色。
中。 • 中：薄血膜中，厚血膜好或中。 • 差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。
疟原虫检验技术
• 2.血片制作和染色合格率要求：分别以血片 制作、染色和清洁度的好、中、差合并计 算合格率。
• (1)血片制作合格率应在85%以上。 • (2)染色合格率应在85%以上。 • (3)清洁度合格率应在80%以上。
稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。
疟原虫检验技术
②清洁液浸泡法：
清洁液配制如下： • 重铬酸钾 80g • 浓硫酸 100ml • 水(清净水)1000ml
疟疾的检查与诊断
疟疾的检查与诊断病原学检查确诊疟疾最可靠的依据是从受检者的外周血中检出疟原虫。
厚、薄血膜染色镜检是目前最常用的方法。
在高度怀疑疟疾时，如果血液涂片为阴性，应当重复涂片镜检。
血液涂片的染色常使用Giemsa染液、Field染液或其他Romanowsky染色劑。
镜检疟原虫时应当同时对厚血涂片和薄血涂片进行检查。
薄血涂片应迅速风干，用无水甲醇固定后染色，然后在油镜（放大1000倍）下检查膜尾红细胞，以每1000个红细胞的寄生红细胞个数表示。
厚血涂片很可能会不均匀，涂片时应充分干燥和染色，不得固定。
计数寄生虫和白细胞（至少200个），并根据总白细胞数目计算单位体积内的寄生虫数目。
在判断厚血涂片为阴性前，应在油镜下检查100～200个区域。
薄血涂片和厚血涂片有着各自的优点和缺点。
薄血涂片中疟原虫的形态完整而典型，容易识别和鉴别虫种，但疟原虫密度低时，容易漏检;厚血涂片制作过程中多层的红细胞相互重叠并且被溶解，因此可以使疟原虫集中（比薄血涂片集中40～100倍），提高检出灵敏度，但由于染色过程中红细胞溶解，疟原虫形态有所改变，虫种鉴别困难。
因此，最好在一张玻片上同时制作两种血涂片，如果在厚血涂片查到疟原虫而鉴别虫种困难时，可再检查薄血涂片。
恶性疟在发作开始时，间日疟在发作后数小时至10余小时采血能够提高检出率。
免疫学检查目前已经广泛使用的恶性疟原虫抗体诊断棒或诊断卡能够快速、简单、敏感和特异地对恶性疟原虫特异性、富含组氨酸的蛋白2（NHRP2）、乳酸脱氢酶或醛缩酶抗原进行检测，并借此将恶性疟和其他危险性较低的疟疾区分开来。
此外，常用的方法还有间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等。
由于抗体在患者治愈后仍能存在一段时间，且广泛存在个体差异，因此检测抗体主要用于疟疾的流行病学调查、防治效果评估及输血对象的筛选，在临床上仅作辅助诊断。
分子生物学技术聚合酶链式反应（PCR）和核酸探针已用于疟疾诊断。
分子生物学检测技术的最突出优点是对低疟原虫血症的检出率较高。
【2017年整理】厚、薄血膜法查疟原虫
厚、薄血膜法查疟原虫基本原理：疟原虫寄生于红细胞，经制片、染色后，显微镜下可以鉴别疟原虫的虫种和虫期。
试剂器材：75%酒精棉球、采血针、载玻片、甲醇、pH7.0~7.2 PBS缓冲液、姬氏染液（或瑞氏染液）、显微镜等。
操作方法：(1)采血：①采血时间在普查时，一般无法考虑采血时间。
在临床上，对现症病人一般可随时采血，但为了提高检出率，就应当考虑采血的适当时间。
对典型发作的间日疟及三日疟患者，应选择发作后数小时至10余小时采血为好。
此时疟原虫发育至环状体乃至大滋养体，虫体大，疟色素已形成，受染红细胞也出现变化，有利于疟原虫的检出。
恶性疟原虫大滋养体和裂殖体是在皮下、脂肪和内脏微血管中发育的，通常在外周血液中不易查到，配子体在环状体出现1周后方能见于外周血液，故在发作时采血。
②采血部位从患者耳垂或指尖（以左手无名指为宜）取血，婴儿通常从大姆趾第二趾骨腹面针刺采血。
③采血方法用75%乙醇棉球消毒取血部位皮肤，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，右手持针迅速刺入皮肤，待血液流出或轻轻挤出血滴，供制作涂片用，采血完毕用干棉球轻压伤口止血。
(2)制片：①薄血膜的制作取1滴血于1张洁净的载玻片上，选1张边缘平整、光滑的载玻片作推片，用左手拇指和中指夹持其两端，将推片的边缘中点与血滴接触，并与载玻片呈30o~45o夹角，待血滴沿推片边缘向两侧展开后，立即由右向左迅速推成薄血膜。
理想的薄血膜要求红细胞均匀地铺成一层，无裂痕，其末端凸出呈舌尖形。
注意：推片时用力和速度要均匀，不能中途停顿或重复推片，以免造成血膜断裂或厚薄不匀。
如取血量多，夹角宜小；取血量小，则夹角可大些。
②厚血膜的制作用推片的一角接触刺血点上的血滴，取血2滴，置载玻片上，并从里向外作旋转涂布，使成直径为0.8cm大小的圆形血膜，厚薄要均匀，然后平置桌上，待自然干燥。
③厚薄血膜同片制作用目测法将载玻片从右到左等分成6格，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部，第1、2格可用于贴标签，制作厚、薄血膜方法同上。
疟原虫检验技术
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断和流行病学调查。
优点
恶性疟原虫免疫荧光染色法
优点
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断、药物治疗监测和流行病学调查等。
原理
以疟原虫特异性DNA片段作为引物，通过聚合酶链反应扩增特异性DNA片段，然后将扩增产物进行电泳分析，以检测疟原虫的存在。
局限性
不同种疟原虫的DNA序列存在差异，因此需要针对不同种疟原虫设计不同的引物。
聚合酶链反应（PCR）
对疟原虫的基因序列进行分析，可了解疟原虫的种群结构、遗传变异和抗药性。
核酸序列分析
分子生物学检验
体外培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊细胞或其它传代细胞系中，进行体外培养，用于分离和鉴定疟原虫。
体内培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊体内，进行体内培养，用于分离和鉴定疟原虫。
流行病学调查
通过对疟疾疫源地进行分析，找出传染源和传播途径，有助于制定针对性的防控措施，控制疫情扩散。
疫源地分析
流行病学调查与疫源地分析
结论与展望
06
疟原虫检验技术的重要性和意义
疟原虫检验技术是疟疾诊断、治疗和防控的关键手段，对于减少疟疾传播、保护人民健康具有重要意义。
疟原虫检验技术的发展和应用，有助于提高疟疾防治效果，降低疟疾发病率和死亡率，为国家和人民节省了大量医疗资源和社会成本。
xx年xx月xx日
疟原虫检验技术
目录
contents
疟原虫检验概述疟原虫检验技术分类各种疟原虫检验技术介绍疟原虫检验技术的应用范围与局限性疟原虫检验的实际应用案例结论与展望
疟原虫检验概述
01
疟原虫检验是指通过实验室手段对患者的血液、组织、排泄物等进行检查，以确诊疟疾感染和评估病情严重程度。
疟原虫检测 血涂片镜检法
ICS11.020C62WS 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 569—2017疟原虫检测血涂片镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准起草单位：海南省疾病预防控制中心、江苏省寄生虫病防治研究所、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、云南省寄生虫病防治所、海南省农垦总局医院。
本标准主要起草人：王善青、高琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李雨春、刘莹、欧阳范献。
疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。
2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。
供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。
3.4 推片。
3.5 血片染色架。
3.6 血片干燥架。
3.7 玻片盒。
3.8 染色盘和染色缸。
4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。
疟原虫检测 血涂片镜检法
疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。
2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。
供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。
3.4 推片。
3.5 血片染色架。
3.6 血片干燥架。
3.7 玻片盒。
3.8 染色盘和染色缸。
4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。
4.5 二甲苯（分析纯）。
4.6 75%酒精。
4.7 一次性采血针。
4.8 一次性手套。
5 检测步骤5.1 血涂片的制作5.1.1 采血部位及取血方法经75%乙醇消毒采血部位，待干后，用一次性采血针在耳垂或指端扎刺取血，婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
取1张已消毒推片，用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4μL～5μL用于制作厚血膜，再用该端中部刮取血液1μL～1.5μL用于制作薄血膜。
5.1.2 厚血膜制作取1张载玻片，将推片左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1.0cm 的圆形厚血膜,厚度以1个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。
疟原虫检测标准操作程序
疟原虫检测标准操作程序疟原虫检测操作程序1.目的与原理1.1 目的：检查血液中是否有疟原虫。
1.2 原理：瑞氏染色原理。
瑞氏染料中含有美蓝和XXX两种染料，前者为碱性，后者为酸性。
它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调，以便于辨认。
根据瑞氏染色的酸碱物质染色性不同，可将疟原虫各期的形态进行清楚染色，便于观察。
高倍镜下一般可以观察到各种类型的疟原虫（如间日疟、三日疟、恶性疟），以及疟原虫的各期，如环状体（早期滋养体）、晚期滋养体、裂殖体、配子体等。
2.样本收集和贮存2.1 原始样本：全血。
2.2 标本类型：EDTA抗凝血2ml。
标本的采集应使用标准一次性采血管，充分混匀，勿震荡。
2.3 保存条件：EDTA抗凝血尽快即时检测。
2.4 病人要求：必须在发烧时采血。
3.试剂3.1 瑞氏染液：3.1.1 试剂成分：瑞氏染料1.0g、无水甲醇500ml、甘油10ml。
3.1.2 配制方法：将瑞氏染料称量好后，放在乳钵中加少量无水甲醇匀速研磨至溶解。
将研磨好的染液倾倒入试剂储存瓶中，倒入无水甲醇继续研磨，反复多次，直至乳钵中无瑞氏染料沉淀为止。
配制好的染液放在37℃24小时后方可使用，放在阴凉干燥处，避光保存。
3.2 磷酸盐缓冲液PH6.4：3.2.1 脱水Na2HPO4 1份：处理方法将Na2HPO4于蒸发皿上干燥（火燃烘烤）成粉末称量。
3.2.2 无水KH2PO4 2.6份：将脱水Na2HPO4 1份和无水KH2PO4 2.6份充分混合，边研磨边混匀。
3.2.3 将上述粉末1g加溶解于500ml去离子水中，混合均匀，方可使用。
3.3 器材：载玻片、加样枪、吸头、推片器。
4.仪器显微镜OLYMPUS型号：CX21.4.1 开机前检查4.1.1 OLYMPUS显微镜：检查显微镜光路系统，目镜、物镜镜头正常，聚光器、光圈、螺旋、微螺旋调节正常。
4.2 日常维护：每日清理纤维镜表面，保持显微镜光圈、聚光器干净整洁。
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血液疟原虫检查
[试验名称] 血液疟原虫检查
[试验方法] 薄血片法或厚血片法
[操作]
1.薄血片法：以常法薄推血片，血膜完全干燥后即可染色。
染色法同白细胞分
类检查
2.厚血片法：在洁净玻片上，滴患者血液2滴，用推片角将血液由内向外转涂
成直径约1cm，厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。
在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟，脱去血红蛋白的血膜呈浅灰色，倾去溶血液。
不必待干，进行染色，干后镜检。
[结果报告]
查见或未查见疟原虫
[注意事项]
1.采血时间：间日疟级三日疟患者应在发作后数小时至10余小时才学，此时，
早期滋养体已发育至易于鉴别的形态晚期；恶性疟患者，应在发作20小时左右采血。
2.厚血片的溶血要及时，厚血片的放置期限在夏季不超过48h，冬季不超过72h，
否则溶血不完全，会影响检验质量。
3.染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣飘浮冲走。
4.玻片油镜检查，须找100或100个以上视野才能报告“未检出疟原虫”。
厚
血片至少20个视野以上。
5.疟原虫须分类报告，找到环状体后，须在仔细寻找更为成熟的阶段，以便分
类。
如确实未找到更为成熟的疟原虫，可报告为“检出环状体疟原虫”
6.有可能出现2种或3种疟原虫混合感染时，以间日疟与恶性疟混合感染最常
见，须注意鉴别。
7.注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。
特别是厚血片检查时，缺乏经验者必
须在薄血片上仔细寻找证实，才能报告。
8.除上述3种疟原虫外，在我国云南曾发现过少数卵形疟原虫引起的病例。
卵
形疟原虫的基本形态与三日疟原虫相似，但虫体稍大，受感染的红细胞略胀
大，滋养体后期与裂殖体前期的原虫呈圆形或卵圆形。