肿瘤靶向治疗_基因检测
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NCCN 2012年版临床治疗指南明确 指出：
患者接受吉西他滨化疗前进行 RRM1 mRNA检测可提高治疗有 效率和患者生存率。
RRM1 mRNA <1.4 >1.4
No. Patients 8 8
Median Survival 15.5 mos 6.8 mos
P 0.0028
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效 相关的临床数据
BRCA1过度表达 •铂类耐药的预测因子 •抗微管类药物的敏感因子
TS高表达影响氟类和培美曲塞药效
• 低TS mRNA水平的肿瘤 患者接受氟类化疗的效 果较好，中位生存期较 长。 • TS低表达的患者对培 美曲赛的疗效好。
方法：
2条正向引物（针对正 常DNA，突变DNA）
1条反向引物
2个平行的PCR反应
普通PCR仪
TaqMan-ARMS技术
TaqMan-ARMS探针技术基于实时PCR平台，结合了 ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。
Taqman-MGB：针对SNP位点特异性扩增的探针，可区分一个碱基的突变。
• 适用于各种肿瘤组织检测，包括石蜡标 本、穿刺标本、冰冻活检标本等。
• 国内采用校准RNA（Calibrator RNA）方法进行基因表达定量。
23
Q-PCR检测基因表达数据库
基础：>5000例样本 人种：中国患者样本
标准：正态分布 定位：精确到1%
统计：p<0.05
RRM1表达与吉西他滨疗效相关的临床数据
+++
5% -
+++ +
+/-
1% 0.01% 耗时
-
-
>6h
+++
-
1.5h
-
-
>6h
-
-
<2h
费用 低
中等 中等
中等
测序技术发展历程
Ion Semiconductor Sequencing （2011）
Next-Gen Sequencing （2005以后）
Sanger Sequencing （1977）
Ion Torrent半导体测序原理
Ion Torrent半导体测序平台及芯片
PI芯片：sequence exomes and whole transcriptomes（5Gb）
目前成熟的肿瘤分子靶向药物敏感性基因检测
肿瘤类型
靶向药物
基因
样本
疗效佳的情况
非小细胞肺癌
易瑞沙（Iressa） 特罗凯（Tarceva）
肿瘤治疗相关基因检测
1.肿瘤个体化治疗
肿瘤分子诊断 循环肿瘤细胞
2. 肿瘤个体化治疗 发展趋势
临床上治疗肿瘤的方法
• 患者对药物是否敏感？毒性是否可耐受？ • 患者治疗后转移复发风险有多高？
个体化治疗：医学概念。应用它不仅降低并发症的发生,还
降低医疗费用。
肿瘤标准化治疗
病理分型
Ⅰ期患者：手术/化疗 Ⅲ、Ⅳ期患者：放/化疗+手术
克唑替尼
EGFR KRAS
EML4ALK融合
手术/穿刺/ 胸腹水/血浆
手术/穿刺/ 胸腹水
EGFR突变/KRAS野生 阳性
胃肠间质瘤
格列卫（Gleevec）
C-Kit PDGFRA
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
C-kit第11外显子突变/PDGFR突变
慢性粒细胞白 血病
格列卫（Gleevec） 达沙替尼(Dasatinib) 尼罗替尼(Nilotinib)
ABL
骨髓/全血
无T315I突变
乳腺癌
拉帕替尼（ LБайду номын сангаасpatinib）
赫塞汀
PI3K Her-2
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
野生型
病理切片
高表达/表达阳性
基因表达量（mRNA）检测
——指导个体化化疗
可使标准化疗方案得到个体化应用
mRNA检测主要技术特色
• 采用荧光定量PCR技术，采用内参比 RNA作为质控对照，应用beta-actin作 为内对照，定量检测检测目的基因 mRNA表达水平。
检测方法：RT-PCR, FISH, PCR-测序等
靶向EGFR的抗肿瘤药物
类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR －TKI)
作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活 性，阻断EGFR信号通路；
药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替 尼（罗氏）。
类别二：单克隆抗体(mAb)
作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与 EGFR的结合；
一个PCR体系中：1对引物，1条探针 每个位点需要做至少两管PCR扩增！！！
应用：对微量突变进行检测。
SNP位点检测应用
EGFR基因突变检测方法灵敏度的比较
检测方法/ 检测灵敏度
100%
直接测序法 +++
TaqmanARMS® 焦磷酸测序
法
+++ +++
Taqman QPCR技术
+++
50% ++ +++ ++
药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）。
基因EGFR热点突变位点
•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21 •耐药突变：T790M
➢靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测
✓ NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药 之前须检测K-ras基因突变检测；
野生型 突变型
✓ K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗（爱 必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治 疗费用；
局部晚期患者：手术、化疗、放疗、靶向
分子分型
肿瘤个体化治疗
标本→基因检测→遗传特性 →选择化疗/靶向药物
克唑替尼的靶标——EML4-ALK融合基因
EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染 色体的p21和p23带
已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体： v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7
✓ 中国人群中K-ras基因突变率15% ！
✓ 15%的病人不应该使用爱必妥！
World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786.
基因KRAS热点突变位点
KRAS主要突变在： 外显子2（密码子12，13 ），3（密码子61）10
个体化检测平台
基因突变检测
——ARMS技术，测序等
ARMS技术——普通PCR
等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA） 建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻滞突变系统
（Amplification Refractory Mutation System ， ARMS）、等位基 因特异性PCR（Allele Specific PCR， ASPCR）等。
患者接受吉西他滨化疗前进行 RRM1 mRNA检测可提高治疗有 效率和患者生存率。
RRM1 mRNA <1.4 >1.4
No. Patients 8 8
Median Survival 15.5 mos 6.8 mos
P 0.0028
ERCC1表达与铂类药物疗效相关 的临床数据
ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.
BRCA1/2表达与铂类药物疗效 相关的临床数据
BRCA1过度表达 •铂类耐药的预测因子 •抗微管类药物的敏感因子
TS高表达影响氟类和培美曲塞药效
• 低TS mRNA水平的肿瘤 患者接受氟类化疗的效 果较好，中位生存期较 长。 • TS低表达的患者对培 美曲赛的疗效好。
方法：
2条正向引物（针对正 常DNA，突变DNA）
1条反向引物
2个平行的PCR反应
普通PCR仪
TaqMan-ARMS技术
TaqMan-ARMS探针技术基于实时PCR平台，结合了 ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。
Taqman-MGB：针对SNP位点特异性扩增的探针，可区分一个碱基的突变。
• 适用于各种肿瘤组织检测，包括石蜡标 本、穿刺标本、冰冻活检标本等。
• 国内采用校准RNA（Calibrator RNA）方法进行基因表达定量。
23
Q-PCR检测基因表达数据库
基础：>5000例样本 人种：中国患者样本
标准：正态分布 定位：精确到1%
统计：p<0.05
RRM1表达与吉西他滨疗效相关的临床数据
+++
5% -
+++ +
+/-
1% 0.01% 耗时
-
-
>6h
+++
-
1.5h
-
-
>6h
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<2h
费用 低
中等 中等
中等
测序技术发展历程
Ion Semiconductor Sequencing （2011）
Next-Gen Sequencing （2005以后）
Sanger Sequencing （1977）
Ion Torrent半导体测序原理
Ion Torrent半导体测序平台及芯片
PI芯片：sequence exomes and whole transcriptomes（5Gb）
目前成熟的肿瘤分子靶向药物敏感性基因检测
肿瘤类型
靶向药物
基因
样本
疗效佳的情况
非小细胞肺癌
易瑞沙（Iressa） 特罗凯（Tarceva）
肿瘤治疗相关基因检测
1.肿瘤个体化治疗
肿瘤分子诊断 循环肿瘤细胞
2. 肿瘤个体化治疗 发展趋势
临床上治疗肿瘤的方法
• 患者对药物是否敏感？毒性是否可耐受？ • 患者治疗后转移复发风险有多高？
个体化治疗：医学概念。应用它不仅降低并发症的发生,还
降低医疗费用。
肿瘤标准化治疗
病理分型
Ⅰ期患者：手术/化疗 Ⅲ、Ⅳ期患者：放/化疗+手术
克唑替尼
EGFR KRAS
EML4ALK融合
手术/穿刺/ 胸腹水/血浆
手术/穿刺/ 胸腹水
EGFR突变/KRAS野生 阳性
胃肠间质瘤
格列卫（Gleevec）
C-Kit PDGFRA
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
C-kit第11外显子突变/PDGFR突变
慢性粒细胞白 血病
格列卫（Gleevec） 达沙替尼(Dasatinib) 尼罗替尼(Nilotinib)
ABL
骨髓/全血
无T315I突变
乳腺癌
拉帕替尼（ LБайду номын сангаасpatinib）
赫塞汀
PI3K Her-2
手术/穿刺/内镜 活检/血浆
野生型
病理切片
高表达/表达阳性
基因表达量（mRNA）检测
——指导个体化化疗
可使标准化疗方案得到个体化应用
mRNA检测主要技术特色
• 采用荧光定量PCR技术，采用内参比 RNA作为质控对照，应用beta-actin作 为内对照，定量检测检测目的基因 mRNA表达水平。
检测方法：RT-PCR, FISH, PCR-测序等
靶向EGFR的抗肿瘤药物
类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR －TKI)
作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活 性，阻断EGFR信号通路；
药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替 尼（罗氏）。
类别二：单克隆抗体(mAb)
作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与 EGFR的结合；
一个PCR体系中：1对引物，1条探针 每个位点需要做至少两管PCR扩增！！！
应用：对微量突变进行检测。
SNP位点检测应用
EGFR基因突变检测方法灵敏度的比较
检测方法/ 检测灵敏度
100%
直接测序法 +++
TaqmanARMS® 焦磷酸测序
法
+++ +++
Taqman QPCR技术
+++
50% ++ +++ ++
药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗 氏）。
基因EGFR热点突变位点
•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21 •耐药突变：T790M
➢靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测
✓ NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药 之前须检测K-ras基因突变检测；
野生型 突变型
✓ K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗（爱 必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治 疗费用；
局部晚期患者：手术、化疗、放疗、靶向
分子分型
肿瘤个体化治疗
标本→基因检测→遗传特性 →选择化疗/靶向药物
克唑替尼的靶标——EML4-ALK融合基因
EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染 色体的p21和p23带
已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体： v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7
✓ 中国人群中K-ras基因突变率15% ！
✓ 15%的病人不应该使用爱必妥！
World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786.
基因KRAS热点突变位点
KRAS主要突变在： 外显子2（密码子12，13 ），3（密码子61）10
个体化检测平台
基因突变检测
——ARMS技术，测序等
ARMS技术——普通PCR
等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA） 建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻滞突变系统
（Amplification Refractory Mutation System ， ARMS）、等位基 因特异性PCR（Allele Specific PCR， ASPCR）等。