免疫血清制备及效价测定-1
免疫血清的制备及效价测定在临床免疫学检验实验教学中的应用
文 献 标 识 码 ：Ｂ
文 章 编 号 ：１６７３—４１３０（２０１３）１０—１３３６—０２
的 健 康 成 年 雄 性 家 兔 ，６只 ／组 。制 备 ］．５ 绵 羊 红 细 胞 （ＳＲＢＣ）悬 液 ４ ℃冰 箱 保 存 备 用 。 免疫 途 径 为 抽 取 １．５ ＳＲ ＢＣ悬 液 ，腹 腔 多 点 注 射 ，时 间为 ２ ｄ短 期 间 隔 免 疫 ，每 只 每 次 ２ ｍＬ，ＳＲＢＣ共 免 疫 ９次 】。 １．３ 方法 １．３．１ 收 集免 疫 血 清 于末 次 免 疫 后 两 周 采 集 兔 静 脉 血 ，置 于无 菌 容 器 ，并 做 好 标 记 ，４ Ｃ冰 箱 中 ２４ ｈ。待 血 清 析 出 后 ，收 集 血 清 分 装 成 小 瓶 ，做 好 标 记 ，一８Ｏ℃冰 箱 保 存 。 １．３．２ 血 球 凝 集 法 筛 选 抗 血 清 将 分 离 的 新 鲜 血 清 灭 活 补
高效 价 、高 特 异 度 的 免 疫 血清 是 免 疫 学 实 验 室 必 不 可 少 的 生物 制剂 ，是 高 等 医 学 院 校 学 生 免 疫 学 实 验 的重 要 内容 ｌ１】。 而 目前 ，在 各 大 医学 院 校 的 医学 实 验 课 中学 生 更 多 应用 的是 市售 的 商 品诊 断试 剂 ，虽 然 方 便 简 单 ，但 是 学 生 对 免 疫 血 清 的 制 备 、 效 价 的 鉴 定 及 制 备 的 注 意 事 项 以及 实 验 结 果 偏 移 与斌 剂 的 关 系 了 解 甚 少 ，同时 极 大 地 增 加 了实 验 费 用 。故 引导 学 生 自己 动 手 制 备 免 疫 血 清 ，对 检 验 专业 的学 生来 说很 有必 要 。 免疫 血 清 的 制 备 是 一 项 综 合 性 实 验 ，在 实 验 中 ，学 生 不 但 能 将 基 础 课 程 和 专 业 课 程 的 理 论 衔 接 起 来 ，同 时极 大 地 培 养 学 生 实 践 动 手 能 力 、科 研 创 新 能 力 和 团 队协 作 精 神 。 １ 实 验 方 案设 计 １．１ 确 定 实验 人员 ２００８级 检 验 专 业 学 生 为 实 验 的 执 行 者 ， 按 成 绩 （好 中差 ）每 ６人 分 为 一 组 ，全班 分 为 ５组 。 １．２ 教师 指 导 学 生 确 定 实 验 方 案 实 验 动 物 为 体 质 量 ２～ ３
1-1 免疫血清制备及效价测定-1
实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋 巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决 定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生 针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体 （polyclonal antibody）。
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。 2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。 这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损 伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器 官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮 下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后 在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头，不要越轨。20 20年12 月12日 星期六 10时9 分59秒1 0:09:59 12 December 2020
效价的测定
二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法实验原理该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。
当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。
实验材料1. 待测免疫血清（浆）2. 20%SRBC3. 补体4. 生理盐水5. 试管实验方法1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。
2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。
3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：管号 1 2 3 4 5A 列1:60 1:120 1:240 1:480 1:960B 列1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280C 列1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。
4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。
5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。
结果判定以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。
注意事项1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。
2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。
思考题1. 影响免疫血清质量的因素有那些？2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？返回。
4-2 免疫血清制备及效价测定-4
补体溶血反应法
实验目的：
了解补体在溶血反应中的作用 熟悉抗血清效价测定方法 掌握补体介导的细胞溶解机理
实验原理：
作为抗原的绵羊红细胞（sheep red blood cell， SRBC）与其对应抗体（溶血素）结合后，通过补体 活化的经典途径激活补体，经过一系列放大的级联反 应，最后形成膜攻击复合体（MAC），产生膜攻击作 用，导致SRBC溶解，发生溶血反应。
1 1:60
弃去 0.25 ml
4 1:120
7
10
弃去 0.25 ml
0.25ml
弃去 0.5 ml
1:240 1:480 0.25ml 0.25ml
弃去
0.75 ml
2 1:80
5 1:160
8
11
0.25 ml
0.25ml
1:320 1:640 0.25ml 0.25ml
弃去
0.25ml
1.0 ml
补体激活途径
经 典 补 体 激 活 途 径
经 典 补 体 激 活 途 径
实验材料：
1. 1％ SRBC悬液 2. 阳性对照溶血素（抗绵羊红细胞抗体，适当稀释） 3. 豚鼠新鲜血清（当做补体用，临用前稀释成适当浓度） 4. 生理盐水 5. 试管架、试管、吸管、37℃水浴箱 6. 自制的小鼠抗SRBC抗血清
摘取小鼠眼球放血：
将小鼠抓出来，放在鼠笼盖上，用右手抓住尾巴，让它向 前爬，用左手抓住耳朵及脑后毛皮，捏紧，使眼珠鼓出来，用小 指和无名指压住鼠尾巴，小镊子夹住并迅速摘出眼球，将小鼠血 收集入一洁净的平皿中。 尔后，通过拉脱颈椎的方法将小鼠处死。
操 作 步 骤：
1）取洁净小试管12支，排列和做标记如下图所示；
生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
西安医学院教案（专业课程）课程名称临床免疫学与检验班级检本1008 专业，层次检验，本科教师武永红专业技术职务讲师授课方式（大，小班，实习）实验学时9学时授课题目（章，节）抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011教学目的：1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。
教学内容：1.细菌培养与免疫原的制备2.“O”和抗“H”血清的制备3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价4.间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教学方法：启发式教学；讲授重点内容。
教具：板书示教教学重点、难点：1. 间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教研室审阅意见（教研室主任签名）年月日教学内容教学手段时间分配抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定（一）细菌培养与免疫原的制备（二）“O”和抗“H”血清的制备（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价（一）细菌培养与免疫原的制备伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板→生理盐水菌液（100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原）（二）“O”和抗“H”血清的制备Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清O/H抗原的免疫程序：日序（天）免疫剂量（ml）免疫途径1 1 皮内五点注射8 1.5 耳静脉注射15 1.5 耳静脉注射22 1.5 耳静脉注射放血方法：颈动脉采血试血方法：试管凝集试验（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。
免疫血清的制备实验报告
实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。
4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。
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制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的 B淋巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗 原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系 产生针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗 体（polyclonal antibody）。
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1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。 这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损 伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器 官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮 下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后 在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头，防止漏液。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的 影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免 疫方案（免疫次数、间隔时间以及免疫佐剂的使用等等）。因此要获得高质量的 免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方案。
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初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10天 时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
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