实验三 叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
实验3、叶绿体色素的提取、分离理化性质 及光合速率测定
2.光对叶绿素的破坏作用 2.光对叶绿素的破坏作用 取上述色素丙酮提取液少许，分装于 支 取上述色素丙酮提取液少许，分装于2支 试管中， 支试管放在黑暗处 支试管放在黑暗处， 试管中，1支试管放在黑暗处，另1支试管放 支试管放 在强光下（太阳光下），经 在强光下（太阳光下），经1-2h后，观察两 ）， 后 支试管中溶液的颜色有何变化。 支试管中溶液的颜色有何变化。
4.H+和Cu2+对叶绿色分子中Mg2+的取代作用 对叶绿色分子中Mg
（1）取两支试管，一支试管加叶绿体色素提取液 ）取两支试管， 2ml，作为对照。另一支试管加叶绿体色素提取液 ，作为对照。 5ml，再加入 ％HCl数滴摇匀，观察溶液颜色变化 数滴摇匀， ，再加入5％ 数滴摇匀 小粒， （2）当溶液变褐后，再加醋酸铜晶体 小粒，微微 ）当溶液变褐后，再加醋酸铜晶体1小粒 加热，观察记载溶液颜色变化情况， 加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试 管相比较。解释其颜色变化原因。 管相比较。解释其颜色变化原因。 （3）另取醋酸－醋酸铜溶液 ）另取醋酸－醋酸铜溶液20ml，置于烧杯中。取 ，置于烧杯中。 新鲜植物叶两片，放入烧杯中，用酒精慢慢加热， 新鲜植物叶两片，放入烧杯中，用酒精慢慢加热， 随时观察并记录叶片颜色的变化， 随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再 变化为止。解释原因。 变化为止。解释原因。
叶绿体色素的分离叶绿体色素的分离1取一张圆形滤纸最好用色层析滤纸剪成圆形在其中心戳一圆形小孔直径约3mm另取一张滤纸条5cm15cm纸条宽度根据培养皿高度确定用滴管吸取浓叶绿素提取液滴沿纸条的长度方向涂在纸条的一边使色素扩散的宽度限制在05cm以内用电热吹风机吹干后重复途几次然后沿长度方向卷成纸捻使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端
叶绿体的分离与荧光观察
实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。
分离过程最好在0〜5C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。
三、实验步骤1. 选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCI溶液，匀浆3〜5min。
2. 匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。
3•将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
4•将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清，沉淀即为叶绿体。
5. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。
6. 撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。
四、结果与分析参考文献《细胞生物学实验》李玲李雪峰着湖南科学技术出版社百度文库《叶绿体的分离与荧光观察》。
叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者:商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。
细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架,这些结构被称为亚细胞组分。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。
离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀.在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。
最后为核糖核蛋白复合体。
由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。
一般差速离心2—3次，分离效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。
若对产物纯度的要求较高,则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种.速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体.叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。
它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集,然后用密度梯度离心纯化,便可用于各种研究.3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。
紫外辐射,可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光.荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失.荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。
实验三、叶绿体色素的提取、分离与性质分析
实验三、叶绿体色素的 提取、分离与性质分析
南京师范大学生命科学学院
一、实验目的
• 掌握叶绿体色素的提取方法； • 掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步 骤； • 掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理
（一）叶绿体色素：
叶绿素a
3:1 (阳生) ２:1 (阴生)
叶绿素的卟啉环：
• 叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为Mg2+。 • 在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁可被H + 取代而形成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则 可形成绿色的铜代叶绿素。
• 铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故 常用此法制做植物的原色标本。
（二）叶绿素的光学性质
叶绿素的吸收光谱
叶绿素的荧光现象
Hale Waihona Puke 1.叶绿素2.类胡萝卜素
叶绿素b 胡萝卜素
2：1
3：1
叶黄素
叶绿素a、b的结构式
类胡萝卜素的结构式
（二）四种色素的化学性质
• 均为亲脂性>亲水性， ∴均不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用 乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 • 极性大小： 叶绿素b>叶绿素a>叶黄素>胡萝卜素。 ∴根据相似相溶原理，在有机溶液中的溶解 度： 叶绿素b<叶绿素a <叶黄素<胡萝卜素。
4、铜代叶绿素反应
• 向叶绿素溶液中逐滴加入浓盐酸，并不断 摇匀，至颜色变化，观察并记录现象； • 向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜， 并在酒精灯上缓缓加热，观察并记录颜色 的变化。 • 记录现象，并分析原因。
五、思考题：
1. 用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等 提取干燥材料中的叶绿体色素，结果会如何？为什么？ ２．研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？ ３．画图说明叶绿体色素纸层析结果，并解释原因。 ４．铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用，这有何 实用意义？
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
实验三 叶绿体的分离、提取、观察
实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23班级：姓名：一．试验目的1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。
2．理解叶绿体的分离与保存环境。
3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。
二．实验原理1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。
分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。
2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。
三．实验用具1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。
2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等四．实验步骤1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。
2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。
3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。
5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。
6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。
7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。
可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。
8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。
9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。
细胞生物学实验指导标准
实验一叶绿体的分离与荧光观察1．实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
2．实验原理叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。
利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。
将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min 离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
在室温下进行分离要迅速。
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
若停止供能，荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
3．实验材料、用品⑴实验材料：菠菜叶片⑵实验药品：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。
⑶实验仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。
4．实验步骤⑴选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。
⑵利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min，或研磨成匀浆。
⑶用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
⑷取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
⑸将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验三叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的
1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。
2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。
3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。
二、实验原理
叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。
由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。
植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。
差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。
先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。
叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。
三、实验仪器、材料和试剂
1．设备与器材。