实验五、叶绿体的分离与观察
细胞生物学实验
实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。
掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理和方法。
二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理和方法。
三．难点：分离和培养原生质体的技术。
四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。
从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。
实验五 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定
• 3、铜代反应：取上述色素提取液加入试管，逐滴加入 浓盐酸，直至溶液呈现褐色，此时叶绿素分子已经遭到 破坏，称为去镁叶绿素，然后加入醋酸铜结晶少许，慢 慢加入溶液，直至出现鲜亮的绿色，此时即形成了铜代 叶绿素。
实验五 叶绿体色素的提取、分 离及理化性质的鉴定
• 一、叶绿体色素的提取与分离
• 1、称取新鲜叶片2 g，放入研钵总加入丙酮5 ml， 少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮10 ml， 以漏一个圆洞，把新华滤纸 剪成20 cm的长条卷成圆柱，一端多次滴上色素提取 液，插入圆形滤纸中间孔中，上面与圆形滤纸齐平
• 五、结果与讨论
• •分析每个实验的结果，注意事项和原因。 • •六、作业 • •1、记录每个实验的结果。 • •2、为什么提取叶绿体色素要加入少许碳
酸钙和石英砂？
• 3、在培养皿中加入展层用的四氯化碳，把上部做 成的滤纸下的含色素圆柱下端浸入展层液，盖上培 养皿上盖，开始展层。等展层液扩散到培养皿边缘 时，取出滤纸，观察同心圆色素带，做好记录。
• 二、叶绿体色素的理化性质 • 1、叶绿体的荧光现象：取上述色素提取液少许于试管
中，分别观察反射光和透射光，比较观察到的颜色不同 并分析原因。
• 4、黄色素与绿色素的分离：取上述色素丙酮提取液10 ml，加入盛有20 ml乙醚的分液漏斗，并沿漏斗边缘加 入30 ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液 分为两层。色素已经全部转入上层乙醚总，弃去丙酮和 水，再加入5 ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗， 静置10分钟，再加入蒸馏水10 ml，摇动后静置分离， 得到黄色素层和绿色素层，分别保留，分析实验结果和 原因。
[训练]实验五_叶绿体的分离与观察
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实验五叶绿体的分离与观察一、实验目的1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。
二、实验原理将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。
然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
三、实验用品(一) 材料:新鲜菠菜（二）器材:普通离心机、组织捣碎机、光学显微镜、500m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、纱布若干、载玻片和盖片等。
（三）试剂:0.35mol/L NaCl 溶液。
四、实验操作----游离叶绿体的制备与观察1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称20g 于100ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。
3、将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。
4、取滤液1.5m1 在1000 r/min 下离心2min。
弃去沉淀。
5、将上清液在3000 r/min 下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。
实验五叶绿体的分离及离体叶绿体的还原活性
三、实验材料
菠菜叶片
四、设备与试剂
➢分光光度计，离心机，照光装置，试管， 移液管，烧杯，纱布，研钵等。
➢NaCl、Tris缓冲液、2.6-二氯吲哚叮酚
五、实验步骤
1. 提取叶绿体：
➢ 称鲜菠菜叶5g，加10 ml 0.35M NaCl、1ml Tris缓冲液、 石英砂，研磨。
➢ 匀浆用脱脂棉过滤。
实验二 叶绿体的分离及离体叶
绿体的还原活性
一、实验目的
➢学习制备具有活性的离体叶绿体和测定 离体叶绿体还原活性的方法。
➢通过学习分离制备叶绿体的技术方法， 加深对希尔反应的理解及对光反应的认 识。
二、实验原理
1、叶绿体的分离: ➢采用离心分级分离。 ➢即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细
胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞ml
煮沸
—— 5min ——
2.6-二氯吲哚叮酚 0.5ml 0.5ml ——
➢ 将三支试管中的溶液倒入对应的比色杯中，以3号试 管调零，620nm处比色。
➢将比色杯置于光源60cm处照光。 ➢每隔1分钟快速读下光密度的变化，连
续进行5~6次读数。
六、实验结果
1
一二三四五 1 2
2
A
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6 时间（min）
3
请对结果 作出解释
七、注意事项
➢2.6-二氯吲哚叮酚 必须在煮沸加热后 滴加。
➢溶液加入比色杯就开始计时。 ➢每次测光时都应调零和百分比。
八、思考题
1. 试管中蓝色褪去的原因是什么? 与光 照有什么关系? 2．煮沸对叶绿体有何影响？
叶绿体测定实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿体色素提取和分离的方法。
2. 掌握叶绿体色素的理化性质和定量分析方法。
3. 了解叶绿素在植物光合作用中的作用。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，其中含有多种色素，包括叶绿素、类胡萝卜素等。
叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光。
通过测定叶绿体色素的吸收光谱，可以了解叶绿素的含量和种类。
本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取植物叶片中的叶绿体色素，然后通过层析法分离叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素，最后测定各色素的浓度，以了解叶绿素的含量和种类。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜叶片、番茄叶片2. 实验仪器：分光光度计、研钵、漏斗、100ml三角瓶、玻璃棒、层析柱、层析板、毛细管、剪刀、镊子、滤纸、吸水纸、移液管、量筒、电子天平四、实验步骤1. 提取叶绿体色素（1）将新鲜菠菜叶片和番茄叶片分别洗净、晾干，剪成小块。
（2）将菠菜叶片和番茄叶片分别称取0.1g，放入研钵中。
（3）加入少量石英砂和碳酸钙粉，再加入3～5ml 95%乙醇。
（4）研磨至组织变白，继续研磨3～5min。
（5）将提取液倒入100ml三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀。
2. 分离叶绿体色素（1）将层析板固定在层析柱上，将滤纸剪成适当大小，覆盖在层析板上。
（2）用移液管吸取少量提取液，用毛细管滴加在层析板上，形成一条细线。
（3）将层析柱置于黑暗环境中，用移液管加入适量无水乙醇，使层析板上的色素溶解并开始分离。
（4）观察层析板上的色素带，分别收集叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素。
3. 测定叶绿体色素浓度（1）将收集到的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别置于100ml容量瓶中。
（2）用移液管加入适量95%乙醇，定容至刻度线。
（3）将溶液倒入比色杯中，用分光光度计在特定波长下测定吸光度。
（4）根据吸光度计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。
五、实验结果与分析1. 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸收光谱图根据实验结果，绘制叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸收光谱图，分析各色素的吸收特性。
细胞生物学试验指导
细胞生物学实验指导细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步，所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。
实验一普通显微镜及其使用（装片观察）一、目的要求：1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。
2、参观了解其他各类显微镜。
二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
三、方法和步骤：1、介绍普通光学显微镜的构造机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。
光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。
2、油镜的原理及使用方法原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。
在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。
3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。
4、注意事项：（1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。
再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。
注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。
（2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍己干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。
5、观察几种细菌标本片。
6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。
四、作业及思考题：1、油镜的原理是什么？2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？实验二、细胞膜的渗透性实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品一、器材50ml烧杯，试管(1〜10cm) ,10ml移液管,试管架。
叶绿体的分离实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿体的分离方法。
2. 观察叶绿体的形态和结构。
3. 了解叶绿体在植物细胞中的分布。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，主要分布在植物的叶片细胞中。
叶绿体含有叶绿素等色素，能够吸收光能并将其转化为化学能。
本实验通过研磨植物叶片，利用叶绿体在水中溶解度低、在丙酮中溶解度高的特性，将叶绿体从细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如菠菜叶）。
2. 实验仪器：研钵、研杵、蒸馏水、丙酮、载玻片、盖玻片、显微镜、酒精灯、镊子等。
四、实验步骤1. 取新鲜植物叶片，用剪刀剪成小块。
2. 将叶片放入研钵中，加入适量蒸馏水。
3. 用研杵充分研磨叶片，使细胞破裂，叶绿体释放出来。
4. 将研磨液过滤，去除叶片碎片。
5. 取少量过滤液，加入等体积的丙酮，充分混合。
6. 静置一段时间，待叶绿体在丙酮中沉淀。
7. 用镊子取出沉淀，滴在载玻片上。
8. 将载玻片放在显微镜下观察叶绿体的形态和结构。
五、实验结果与分析1. 观察到载玻片上的叶绿体呈绿色，呈扁平的椭球形或球形。
2. 叶绿体在显微镜下具有明显的网状结构，其中包含类囊体、叶绿素等成分。
3. 通过比较实验前后叶绿体的形态和结构，可以判断叶绿体在植物细胞中的分布。
六、实验讨论1. 实验过程中，为什么加入丙酮可以使叶绿体沉淀？答：叶绿体在水中溶解度低，在丙酮中溶解度高，加入丙酮可以使叶绿体从溶液中沉淀出来。
2. 实验过程中，为什么研磨叶片时需要加入蒸馏水？答：蒸馏水可以破坏细胞结构，使叶绿体释放出来，同时保持实验液的清洁。
3. 实验过程中，为什么需要过滤研磨液？答：过滤可以去除叶片碎片，保证实验结果的准确性。
4. 实验过程中，为什么需要观察叶绿体的形态和结构？答：通过观察叶绿体的形态和结构，可以了解叶绿体的基本特征，进一步了解其在植物细胞中的分布和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物叶片中的叶绿体，并观察到叶绿体的形态和结构。
叶绿体特征研究实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解叶绿体的基本结构、功能和生理特性。
2. 掌握叶绿体色素的提取、分离和鉴定方法。
3. 学习使用显微镜观察叶绿体的形态和分布。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中的一种重要细胞器，负责光合作用，将光能转化为化学能，为植物生长提供能量。
叶绿体主要由类囊体、基质和基质蛋白组成，其中类囊体是光合作用的主要场所。
叶绿体中含有多种色素，如叶绿素、类胡萝卜素等，这些色素对光的吸收和传递起着重要作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如菠菜、甘蓝等）、酒精、碳酸钙、石英砂、蒸馏水、滤纸、剪刀、研钵、漏斗、三角瓶、烧杯、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管等。
2. 实验仪器：显微镜、研钵、漏斗、三角瓶、烧杯、剪刀、研钵、滤纸、载玻片、盖玻片、滴管等。
四、实验步骤1. 叶绿体色素的提取与分离（1）取新鲜植物叶片1克，洗净、擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）加入少量石英砂、碳酸钙粉和2-3 mL 95%乙醇，研磨至糊状。
（3）再加入2-3 mL 95%乙醇，继续研磨，直至形成均匀的糊状物。
（4）将糊状物倒入漏斗中，用滤纸过滤，收集滤液。
（5）将滤液倒入三角瓶中，加入少量碳酸钙粉，充分搅拌，静置一段时间。
（6）取少量滤液，滴在滤纸上，用铅笔轻轻画出滤液滴的形状，作为色素带的标记。
2. 叶绿体色素的鉴定（1）观察滤纸上的色素带，记录各色素带的颜色、宽度和位置。
（2）将滤纸上的色素带与标准色素带进行对比，确定各色素带的成分。
3. 叶绿体的观察（1）取新鲜植物叶片，制作临时装片。
（2）将装片置于显微镜下，观察叶绿体的形态、大小、分布和数量。
五、实验结果与分析1. 叶绿体色素的提取与分离实验中，从新鲜植物叶片中成功提取了叶绿体色素，并分离出叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等色素。
2. 叶绿体色素的鉴定通过观察滤纸上的色素带，并与标准色素带进行对比，确定各色素带的成分。
实验结果与理论相符。
3. 叶绿体的观察在显微镜下观察到叶绿体呈椭球状，分布在细胞质基质中，数量较多。
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胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可 以看到绿色的基粒。
• 2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色 荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,
气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红
色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮 细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红 色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍 为绿色。
Differential centrifugation
High speed
Low speed
• 试剂与器械
• 1. 器材 : 普通离心机、组织捣碎机、粗 天平、荧光显微镜。烧杯2个, 250ml量筒 1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试 管架5个，纱布若干，载片和盖片各4片。
• 2. 试剂: 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖 啶橙(acridine orange)。
三.实验步骤 （一）叶绿体的分离与观察
1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体 (混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。
2. 用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测 量5-10个叶绿体，求其大倍数下测微尺的单位。
2. 鸭红细胞直径为多少微米.
• 3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红 色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍 为绿色。
• 作业 1. 根据荧光观察结果，绘制菠菜叶气孔 的结构模式图。
• 思考题：
• 1. 叶绿体分离的实验原理是什么？在分 离叶绿体时应注意些什么问题？
五. 实验结果
1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可 看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
• （二）菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶 ↓ 刀片切出一斜面置于载玻片上 ↓ 滴加1~2d氯化钠溶液 ↓ 盖上盖片显微镜下观察
• 实验结果 （一）叶绿体的分离和观察
1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在 高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗 粒，即基粒。
2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激 发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件 下，叶绿体发出火红色荧光。
3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光， 而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
• （二）菠菜叶手切片观察 1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细 胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细 胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3) 叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细
实验六 叶绿体的分离与观察
• 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细 胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
• 实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞 器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并 了解荧光显微镜的使用方法。
• 实验原理
• 组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 是分离细胞器的常用方法。