生物血清中的细胞因子测定方法探讨
高致病性猪蓝耳病自然病例血清致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的测定与分析
高致病性猪蓝耳病自然病例血清致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的测定与分析李建臻;杨苗;徐刚【摘要】To find the relationship among IL-1、IL-6、TNF-α content in blood sera of HP-PRRSV infected pigs,so to explain the pathogenesis of HP-PRRS,and to provide a theoretical basis for the prevention and control of HP-PRRS,48 blood sera samples from 4 farms in Chengdu were sampled and tested by ELISA,including 25 RT-PCR positive samples with clinical symptoms and 11 positive samples without clinical symptoms and 12 negative samples. The results showed that the difference of IL-1 in positive pigs was significant(P<0.01) compared with the other two groups,and the dif-ferences of IL-1 between the other two groups were notsignificant(P>0.01) . The differences of IL-6 levels among the three groups were significant(P<0.05),and IL-6 in positive samples with clinical symptoms were higher(P<0.05) than the other two groups. The differences of of IL-6 in the other two groups with negative results were not significant(P>0.05). The differences of TNF-α among the three g roups were not significant(P>0.05). These results showed that IL-1and IL-6 increased in blood serum when pigs were infected by HP-PRRSV and played important role in infection, while TNF-α has little change.%本试验旨在探究高致病性蓝耳病（HP-PRRS）自然病例中致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量，进而阐述HP-PRRS的致病机理，为养殖生产中的HP-PRRS防控提供理论基础。
细胞因子的ELISA方法检测
实验报告1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。
在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。
2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。
3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。
混匀后其浓度约为1000pg/ml。
4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。
其浓度变为500pg/ml。
以此类推，一直加到第2孔。
吸去多余的100微升。
5.向第8、9孔各加入100微升样品1。
10、11孔加入100微升样品2.6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。
7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。
8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。
9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。
静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。
在吸水纸上拍干孔中液体。
10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。
封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。
11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。
再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。
在吸水纸上拍干孔中液体。
12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。
晃动酶标板混匀。
将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。
13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。
14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。
15.用酶标仪在450nm处测OD值。
结果如下：16. 分析结果：将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。
根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。
根据2个标本的OD值标出其在OD值普通坐标上的位置，虚线连接其在标准曲线上的位置，再用虚线连接确定其在浓度坐标上的位置。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。
在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调整、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
细胞因子的检测不仅是基础免疫讨论的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观看、疗效推断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采纳的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来肯定的困难。
因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类一.生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是依据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci 激造血细胞集落形成，IFN爱护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1．细胞增殖法很多细胞因子具有细胞生 zhang 因子活性，特殊是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大细胞生 zhang 、IL-6 ci 激浆细胞生 zhang 等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依靠于某种因子的细胞系，即依靠细胞株(简称依靠株)。
这些依靠株在通常状况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依靠株ctll-2在不含IL-2的培育基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外 zhang 期培育。
在肯定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖状况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依靠株外，还有一些短期培育的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ在急性白血病患者感染中的诊断价值
143 Journal of China Prescription Drug Vol.19 No.4·临床研究·急性白血病是临床上常见的恶性肿瘤之一，是早期造血前体细胞突变导致的造血系统恶性肿瘤。
随着生活方式的变化，近年来白血病的发病率逐年升高，而化疗药物及广谱抗生素等的使用更降低了白血病患者的免疫机能，增大了感染的风险，研究表明[1]，急性白血病患者医院感染率为67.5%左右。
而严重感染将进一步中断或延长治疗进程，严重者甚至可能会影响其预后。
因此早期、快速地诊断感染对临床治疗尤其重要。
而急性白血病患者的感染，常常因症状和体征不典型，不能尽早明确感染部位及感染源，无针对性的抗感染治疗，导致感染相关死亡率很高。
白细胞计数是检测感染的常用指标，但由于白血病的特殊性，导致白细胞计数敏感性降低，因此在临床中需要联合其他指标进行检测。
在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8、IL-10等。
因此本研究就细胞因子对急性白血病的感染诊断效果进行了探究，报告如下。
1 资料与方法1.1 一般资料选取我院收治的15例白血病感染患者为观察组，11例白血病未感染患者为对照组，时间范围为2019年8月～2020年8月。
观察组男9例，女6例；平均年龄为（46.40±13.91）岁；对照组男6例，女5例，平均年龄为（43.00±13.97）岁。
两组患者的性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。
纳入标准：①经骨髓细胞学及细胞免疫分型等方法临床诊断为急性白血病；②入组前2周无抗生素使用史；③感染前体温处于正常范围；④诊断为感染患者，诊断标准[2-4]：单次腋温超过38.5℃，或者12 h内超过2次体温升高至38℃以上。
排除标准：①合并免疫性疾病或神经系统疾病的患者；②合并其他脏器功能障碍的患者；③合并其他系统肿瘤患者；④自动出院放弃化疗患者；⑤其他原因所致死亡患者。
细胞因子与细胞黏附因子的测定
细胞因子与细胞黏附因子的测定第一节生物学测定方法常见的生物学测定法包括：基于DNA检测的分子生物学测定法和生物活性测定法。
前者有细胞因子或细胞黏附分子DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析等，可定性或定量分析细胞因子和细胞黏附分子的基因或mRNA。
后者则是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，主要用于细胞因子的测定。
生物活性测定法的基本原理，是根据不同细胞因子所具有的某一方面独特的生物学活性，构建发挥这一活性的反应体系，通过观察其活性作用的结果，判断有无相应细胞因子的存在。
有助于细胞因子检测的活性作用大致有以下几类：1.刺激细胞增殖或集落形成的活性；2.维持细胞生长和存活的特性；3.抑制细胞生长或破坏细胞的效应；4.促进细胞趋化或抗病毒作用等。
一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法1.直接计数法2.细胞代谢活性测定方法3.细胞代谢产物测定法常用放射性核素掺入法和MTT比色法二、细胞毒活性测定法对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。
因此，待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。
本法常用于TNF等的测定。
三、抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法主要用于IFN等细胞因子的检测。
四、趋化活性测定法其诱导细胞迁移的方式包括趋化性和化学增活性。
趋化性可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定。
化学增活性可采用琼脂糖小滴化学动力学试验测定。
五、生物学活性测定方法学评价细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：1.敏感性较高2.特异性不高3.操作繁琐4.易受干扰第二节免疫测定方法一、ELISA方法双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。
细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。
细胞因子的检测方法
是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
4．细胞增殖法
许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，可根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。在检测细胞因子时，必须考虑到细胞因子的作用具有网络性的特点，人们需明确检测方法所测定的细胞因子成分，并考虑其抑制剂和可溶性受体的水平，将各种结合使用，有可能得到较为可靠的结果。
生物体中细胞因子的分析与定量
生物体中细胞因子的分析与定量细胞因子是生物体中起重要调节作用的一类蛋白质分子，它们通过细胞间信号传导调节各种生理过程和免疫反应。
因此，准确的细胞因子测定对于临床诊断和治疗具有非常重要的应用价值。
本文将介绍几种常见的细胞因子分析和定量方法。
1. 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA是一种常用的细胞因子定量方法，其基本原理是利用特异性抗体识别和定量特定蛋白质分子。
一般将含有细胞因子的样品加入包含特异性抗体的孔板中，经过洗涤和添加酶标记抗体的步骤后，加入荧光素底物使其反应，最后通过发光仪器检测荧光素的信号强度来计算样品中的细胞因子浓度。
ELISA具有检测范围广、敏感度高的优点，但也存在一些限制，例如可能存在交叉反应、抗体不专一等问题。
2. 生物芯片技术生物芯片技术是一种高通量的细胞因子测定方法，可以同时检测多种生物标志物。
其基本原理是将含有细胞因子的样品加入芯片表面上的抗体微阵列区域，经过识别和荧光标记后，利用扫描仪采集数据并进行分析处理，从而获得样品中细胞因子的浓度等信息。
生物芯片技术具有检测速度快、检测范围广、多重检测等优点，适用于大规模筛查和研究样本数量较大的场景。
3. 质谱分析技术质谱分析技术是利用原子或分子的质量特征对样品进行分析、鉴定和定量的一种方法。
对细胞因子的质量谱分析可以确定其分子量和结构等信息，从而实现对其浓度的定量和分析。
质谱分析技术的优点是具有高精度、高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围，但需要较高的分析技术和设备支持，价格较高。
4. 生物传感器技术生物传感器技术是一种新型的细胞因子监测方法，其基本原理是通过导入特异性受体或适体的细胞或融合蛋白质来检测特定的生物分子，如细胞因子。
此类传感器具有实时监测、无需标记和较低的检测限制等优点，适合于高通量和非标记检测等场景。
总结细胞因子是生物体内调节和维持机体稳态的重要蛋白质分子。
随着生物技术的发展和方法的不断更新，我们现在可以采用多种分析和定量方法来对细胞因子进行检测。
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生物血清中的细胞因子测定方法探讨
随着生物医学技术的不断发展，细胞因子作为生物学中重要的分子被越来越多
地应用于实验和临床研究中。
然而，在测定生物血清中细胞因子含量时，由于其浓度较低、种类繁多以及受到多种干扰因素的影响，使其检测方法显得困难和繁琐。
本文将就生物血清中细胞因子测定方法进行探讨，并提出一些方法以供参考。
一、细胞因子的基本概念
细胞因子是由生物体内多种细胞产生的蛋白质类信号分子，可以通过自分泌和
旁泌作用来调控免疫反应、细胞增殖、分化和组织再生等生物学过程。
目前已知的细胞因子种类有数百种之多，而这些细胞因子种类又有相互协作和竞争的关系，因此对其含量进行精确定量分析就显得尤为重要。
二、生物血清中细胞因子检测的方法
目前生物血清中细胞因子的检测方法主要有ELISA、RT-PCR、Western blot等
多种方法。
其中ELISA法是一种最常用的测量方法，具有快速、高灵敏度和高特
异性等特点。
而RT-PCR法和Western blot法虽然具有高灵敏度的优势，但其前处
理繁琐、操作复杂、结果易受到内标伦比的影响等缺点也难以避免。
三、细胞因子测定时需考虑的干扰因素
在细胞因子测定过程中，还需考虑到一些可能会影响测定结果的干扰因素。
如：样品加工的预处理方式，如离心速度和时间、冷冻温度、冷冻时间和样本稀释倍数等；误差估计的不确定因素，如ELISA方法引入的变异性、Batch间和Batch内变
异性、抗体批次变异性和样本保存变异性等。
四、建立标准曲线
为了保证测量结果的准确性和可靠性，建立一个符合实测样品特征的标准曲线
是必不可少的。
标准曲线要求有代表性且范围广泛，可以反映实验所检测的范围。
通过标准样品测定得到的数据可用于制定标准曲线方程和计算样品中细胞因子的浓度。
五、控制样品的干扰
在细胞因子检测过程中，为了控制样品的干扰，常采用检测标准曲线范围内小
波动系数(CV)的实验数据作为质量控制(QC)样品。
同时，对于过高浓度或过低浓
度的样本，要进行稀释或加样处理，以避免实验结果的过于离谱。
六、细胞因子测量的数据处理与结果分析
为了确定血清中细胞因子浓度的实际值及其与其他因素的关系，需进行数据处
理和结果分析。
常见的数据处理方法包括回归分析、方差分析和分位数回归等。
结果分析常采用差异表达分析、双变量Pearson相关分析和组学分析等。
七、结论
生物血清中细胞因子检测可应用于细胞因子相关疾病的早期诊断、治疗和预防，同时也可以为新药开发提供支持。
细胞因子测定的结果需要通过科学严谨的实验设计和数据处理来保证其准确性和可靠性。
同时，为了更好地控制干扰因素，多一些实验人员的经验沉淀和技巧的积累也是有益的。