生物工程专业分析 复习资料

第一章：分析概论

1.分析的分类

（1）按生物工程分析的对象及检测项目的性质，可分为：

A.感官、理化指标的测定

B.结构分析及序列分析

C.活体、生物活性及功能成分的检测。

D.实时分析及过程参数检测

⑵. 按照分析方法的技术原理可将其内容划分为一下几个主要方面

①感官检验法 ②物理检验法 ③化学检验法 ④物理化学检验法 ⑤生物检验法

2.分析中的常识

常量分析——样品中组分＞ 1 %

微量分析——样品中组分= 0.1 %～1 %

痕量分析——样品中组分＜ 0.1 %

超微量分析——样品中组分 PPM ——parts per million （ mg / kg )或（ mg / L ) 10-6

PPB —— parts per billion 10-9

PPT —— parts per trillion 10-12

3.分析中的一般规定

水为蒸馏水、去离子水

常用带刻度的玻璃仪器是在20℃条件下标注的。

分样筛——用来筛分体积大小不同的固体颗粒的筛子。

分子筛——具有均一微孔结构而能将不同大小分子分离的固体吸附剂。

“称取”——称至0.1g 。

“精密称取”——必须按所列数值称取，精确至 0.0001g 。

“精密称取约”——必须精确至0.0001g ，可接近所列数值，不超过所列数值的10% 。 分析中所用的试剂，除特别标明的外均为分析纯溶液；未指明用何种溶剂配制时均指水溶液。盐酸、硫酸、硝酸、氨水等未指明具体浓度时，均指市售试剂规格的浓度

液体的“滴”系指自滴定管留下的一滴的量，在20℃时20滴相当于1.0ml

吸取是指用移液管或吸量管取液体物质的操作；量取是指用量筒或量杯取液体的操作,其精度要求均用数值的有效位数表示

空白试验是化学分析中作比较常用的分析方法，当进行某一试样分析时，同时做一空白试验（即操作条件和所用试剂均相同，但无试样存在），以校正有关因素对分析结果的影响 恒重是指在规定的条件下，连续两次干燥或灼烧后的质量之差不超过规定的范围（一般在0.2~0.5mg 以下）

4.不同分析方法结果差异性的检验

（一）t 检验法 检验样本均值与总体均值是否有差异时，使用：

S 为标准差,x 为样本均值，μ为总体均值

样本计算值的统计量大于t 分布表中相应显著性水平α和相应自由度f 下的临界值，则表明被检验的均值有显著性差异，反之差异不显著。

（二）F 检验法

计算两组数据的方差之比来检验两组数据是否存在显著性差异。

当计算所得F 值大于F 分布表中相应显著性水平α和自由度f1、f2下的临界值，则两组方差之间有显著性差异，反之无。

n s x t /μ-=

5.可疑值的取舍,介绍两种方法：

（1）t i确定法 t i = X i - X / R

R 极差 X 算术平均值 X i可疑值

据平行测定总次数N、显著性水平α值查表，求出t i 表，若t i＞ t i 表则舍去可疑值，若t i≤ t i 表则应保留可疑值。

（2）Q 确定法

先要把平行测定的数据由小到大排列，求得极差R和d值——可疑值与最临近的数据间的差值。

Q = d / R 据平行测定总次数N、概率p查表，求出Q表，若Q＞Q表则舍去可疑值，若Q ≤Q表则应保留可疑值。

6.提高分析结果的准确度，减少不确定度的方法

①选择合适的分析方法

②减少测定误差

③增加平行测定次数，减少随机误差

④消除测量过程中的系统误差

第二章:样品的采集与预处理

1.样品采集的基本原则

（1）采集的样品要均匀、有代表性，能反映全部被检样品的组成、质量和卫生状况。（2）采样方法要与分析目的一致。

（3）采样过程要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散（如水分、气味、挥发性酸等）。（4）防止带入杂质或污染。

（5）采样方法要尽量简单，处理装置尺寸适当。

2.采集步骤

检验

|

检样——原始样——平均样品——复检

|

仲裁、备查

3.对生物活性样品采集的注意事项

(1).动物组织的采集

A生物活性物质易失活与降解，必须保持材料的新鲜，防止腐败、变质与微生物污染。

B快速、速冻、低温保存

（2）动物细胞的培养

动物细胞的生长培养液有平衡盐溶液、天然培养基和合成培养基

平衡盐溶液具有保持渗透压、控制酸碱平衡的作用，也能提供给细胞生存所需要的能量和离子。

（3）动物的血液、唾液、尿液等

药物分析中最常用的血样为全血、血浆和血清。血浆的取得是在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取。加入后立即轻轻旋摇。但勿太猛烈，以免血细胞破裂（4）微生物菌种的选育

A菌种分离（含菌样品收集、富集培养、菌种纯化）

B菌种筛选（筛选对象选择、培养方式确定）

C菌株的选育（随机选择突变体、根据代谢的调节机制选择高产突变体）

4.生物活性样品的保存

（1）动物组织保存：速冻、冻干、有机溶剂脱水、制成丙酮粉或浸存于丙酮与甘油中

（2）动物细胞的保存：组织块保存法、细胞悬液保存法、单层细胞保存法及低温冷冻保存（液氮）

（3）血液、尿液、唾液保存：一般要立即分析。冷冻、冷藏，临用时融化

（4）菌种的保藏（菌种不死亡、保持菌种原有特性）：斜面、矿物油、索氏法、干硅胶法、沙土管法、冷冻干燥法、甘油冷冻保存法

5. 预处理的目的.原则

目的：①测定前排除干扰组分；（2）对样品进行浓缩。原则：①消除干扰因素；②完整保留被测组分；③使被测组分浓缩；以便获得可靠的分析结果。

6.预处理的方法

（1）有机物破坏法（2）蒸馏法（3)溶剂提取法（萃取法）（4）盐析法

（5）.磺化法和皂化法（6）沉淀分离法（7) 掩蔽法（8）色谱分离法（9）浓缩

7.有机物破坏法

（1）干法灰化：原理：将样品至于电炉上加热，使其中的有机物脱水、炭化、分解、氧化，在置高温炉中灼烧灰化，直至残灰为白色或灰色为止，所得残渣即为无机成分。（2）湿法消化：原理：样品中加入强氧化剂，并加热消煮，使样品中的有机物质完全分解、氧化，呈气态逸出，待测组分转化为无机物状态存在于消化液中。（3）紫外光分解法：高压汞灯提供紫外光。85±5 ℃，加双氧水。（4）微波高压消煮器。样品最多只要10分钟（2.5 MPa);（5）其它方法：高压密封消化法，自动回流消化仪消化法。

第三章：物理分析方法

1.物理检测方法

相对密度法折光法旋光法

2.色散现象的产生及黑白分明现象的产生原理

色散现象：测定时光源通常为白光，当白光经过棱晶和样液发生折射时，因各色光的波长不同，折射程度不同，折射后分解成多种色光黑白分明现象的产生原理：光的全反射现象

3.影响折射率的因素及消除的法。

⑴光波长的影响：色散现象：测定时光源通常为白光，当白光经过棱晶和样液发生折射时，因各色光的波长不同，折射程度不同，折射后分解成多种色光。光的色散会使视野明暗分界不清，产生测定误差，为消除色散，安装了色散补偿器，可消除色散。

⑵温度的影响：溶液的折射率随温度而改变，温度升高折射率减小；温度降低折射率增大，折光仪上的刻度是在标准温度下（20℃）刻制的，所以若测定温度超过20℃，加上校正数，低于20℃，减去校正数。

4.旋光法

（1）旋光度——当偏振光通过光学活性物质溶液时，偏振面旋转的角度叫作该物质的旋光度。旋光度的大小与光源的波长、液层厚度、光学活性物质的种类、浓度、溶剂及其温度有关。(2)比旋光度——在一定温度和一定光源情况下，当溶液浓度为 1 g/ml ，液层厚度为 1分米时偏振光所旋转的角度。记为：

= α/ L C ——查手册得到不同物质的比旋光度。

α——测定样液的旋光度。 L——旋光管长度（液层厚度）分米。

C——样液浓度（所求值） t——测定温度为20℃λ——光源波长通常为D钠线589.3nm (3)变旋光作用：具有光学活性的还原糖类，在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后惭渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋光作用。

5.如何对应变旋光

在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需立即测定，可将中性溶液(pH7)加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚显碱性。

在碱性溶液中，变旋光作用迅速，很快达到平衡。但微碱性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破坏果糖。

6. 啤酒色度的测定

1．原理：将除气后的啤酒注入 EBC 比色计的比色皿中，与标准 EBC 色盘比较，目视读数或自动数字显示出啤酒的色度，以 EBC 色度单位表示。

2．仪器：EBC 比色计(或使用同等分析效果的仪器)：具有 2.O～27.0 EBC 单位的目视色度盘或自动数据处理与显示装置。一般淡色啤酒的色度在 5.0～14.0 EBC 范围内；浓色啤酒的色度在 15.0～40.0 EBC 范围内。

7. 测定水的色度有:

(1)铂钴比色法——测定水的色度的标准方法.

铂钴标准比色法（GB11903-89）是将一定量的氯铂酸钾（K2PtCl6）和氯化钴（CoCl2 6H2O）溶于水中配成标准色列。

定义：1升水中含1mg铂和0.5mg钴所具有的颜色定为1度。将待测水样与标准色列进行目视比色，以确定其色度。

此法操作简便，色度稳定，标准比色系列保存适宜，可长时间使用，但其中所用的氯铂酸钾太贵，大量使用时不经济。

(2)铬钴比色法——以重铬酸钾代替氯铂酸钾，便宜而且易保存，只是标准比色系列保存时问较短。

两种方法的精密度和准确度相同。

第四章：光谱分析

紫外-可见光吸收法

紫外-可见光吸收光谱：σ→σ*、n→σ*、n→π* 、π→π*

1．生色团:：有机物中含有n →π* 或π→π* 跃迁的基团；

2．助色团:：助色团是指带有非键电子对的基团；可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团

3．红移与蓝移（紫移）

某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应。

在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移（紫移）效应。

4．溶剂效应：溶剂极性的波动也会引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移，这种作用称为溶剂效应

5.比尔吸收定律：入射光被溶液吸收的程度与溶液厚度（L）和溶液的浓度（C）关系为：

A=kcL

式中：A为吸光度；k为消光系数

6．吸光度与浓度之间常常偏离线性关系，产生偏离的因素有：

①样品溶液因素：比尔定律通常只有在稀溶液时才成立，随着溶液浓度增大，吸光质点之间距离缩小，彼此间相互影响和相互作用加强，破坏了吸光度与浓度之间的线性关系

②仪器因素：比尔定律只适用于单色光，但是经仪器狭缝投射到被测溶液的光，并不能保证理论要求的单色光，这也是造成偏离比尔定律的一个重要因素。

7.紫外-可见分光光度计主要部件：光源、分光器、吸收池、检测器、记录器。

8.显色与操作条件的选择

（1）反应条件的选择：①显色反应与显色剂浓度②溶液酸度③显色时间④湿度⑤溶剂（2）测定条件：①波长②狭缝的选择③吸光度范围(0.1---1.0) ④仪器误差

（3）干扰离子的消除：①控制测定条件：可选择适当的波长，将待测组分的吸收峰波长与相距较大的干扰组分影响消除掉；利用氧化剂或还原剂改变干扰离子的价态，使其不影响组分的测定；控制酸度达到选择配位化合物的形成。②加入掩蔽剂：掩蔽剂的作用是与体系干扰组分进行配位化合反应，降低干扰物质的浓度，减少对待测组分的影响。

（4）参比溶液的选择：①溶液参比：当样品比较简单，共存的组分对测定波长的光吸收很小时，可用溶液作为参比溶液，这样可以消除溶剂、吸收池等因素的影响。②试剂参比：试剂参比又叫空白参比。多数情况都采用试剂溶液做参比。按显色反应的相同条件，以不加试样的溶液作参比溶液。这种参比溶液可以消除试剂中的组分产生吸收的影响。

9.分子吸收光谱的产生

在分子中存在着电子的运动，以及组成分子的各原子间的振动和分子作为整体的转动。分子的总能量可以认为等于这三种运动能量之和。即：

E分子= E电子+ E振动+ E转动

10.吸收定律能够用于彼此不相互作用的多组分溶液。它们的吸光度具有加合性，且对每一组分分别适用，即：

A总= A1+ A2+ A3…+ An

=ε1bc1+ε2bc2+ε3bc3…+εnbcn

吸收定律对紫外光、可见光、红外光都适用

11.干扰离子的影响和消除方法：

1．与试剂生成有色配合物及大量干扰离子与试剂生成稳定的配合物；2．干扰离子本身有色；3．与被测离子形成难离解化合物。

消除干扰的方法主要有以下几种：1．控制酸度：2．加入掩蔽剂；3．分离干扰离子；4．进行同时测定；5．利用氧化还原反应改变价态；6、用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰；7、选择适当的波长；8、分离：以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。

原子吸收分光光度法

1.原子吸收是一个受激吸收跃迁的过程。当有辐射通过自由原子蒸气，且入射辐射的频率等于原子中外层电子由基态跃迁到较高能态所需要能量的频率时，原子就产生共振吸收。锐线光源：光源发射线的中心频率与吸收线的中心频率一致，而且发射线的半宽度比吸收线的半宽度小得多时，则发射线光源叫做锐线光源。

2.原子吸收分光光度计：

（1）光源：①能辐射出半宽度比吸收线半宽度还窄的谱线，并且发射线的中心频率应与吸收线的中心频率相同。②辐射的强度应足够大。③辐射光的强度要稳定，且背景小

1.（2）原子化装置：1.火焰原子化器(火焰原子化法是利用气体燃烧形成的火焰来进行原

子化的。火焰型的原子化系统我们把它叫做火焰原子化器。):由雾化室（将试液物化）、混合室（试液与燃气混合）和燃烧器（产生火焰，使进入火焰的气溶胶蒸发和原子化）组成。 2.非火焰原子化器(常用的非火焰原子化法主要有电热高温石墨管原子化法和化学原子化法)：用电加热法使试样干燥、灰化、原子化。

（3）分光器：把待测元素的共振谱线和其他谱线分开，以便进行测定。

（4）检测系统：包括检测器、信号处理和显示记录部件。作用是将光信号转变成电信号，经放大器放大，再将由放大器输出的信号进行转换，使指示仪表上显示出与试样浓度成线性关系的数值。

3．化学干扰的消除：化学干扰：化学干扰是指在溶液中或气相中由于待测元素与其它组分之间的化学反应而引起的干扰。方法：①使用高温火焰②加入稀释剂：在测定时加入一种能与干扰组分生成更稳定或更难挥发化合物的试剂，而使待测元素释放出来，从而消除干扰。

③加入保护剂：加入一种能与待测元素生成稳定增长化合物的试剂，使得待测元素不与干扰组分反应。而生成的化合物又很容易挥发和原子化，对测定不干扰。④预分离：将待测组分和干扰组分分离⑤在石墨炉原子吸收法中，加入基体改进剂可以提高被测物质的灰化温度或降低其他原子化温度以消除干扰。

4.测定条件的选择：①吸收线②光谱通带的选择：吸收线附近无干扰谱线存在并能分开最靠近的非共振线为原则③空心阴极灯的工作电流：使用较低的工作电流④燃烧器高度的选择：选择燃烧器高度使光束从原子浓度最大的区域通过，这个区域的火焰稳定，干扰小。⑤原子化条件选择⑥进样量的选择：3—6ml/min 为适宜

红外光谱法

1．产生的原理：分子中的原子有相对振动，因振动的能量不同，又分为若干能级，当照射红外光能量的大小与分子中原子的振动能级在数量上相当，即能引起分子中振动能级的跃迁，从而产生红外吸收光谱。

2．产生的必要条件：①光辐射的能量恰好满足振动能级跃迁所需的能量。②在振动过程中，分子必须有偶极矩周期性的变化。另外，若振动方式不同而频率相同时，会产生简并作用。3．基频峰：分子吸收一定频率的红外光后，振动能级由基态跃迁至第一激发态时所产生的吸收峰称为基频峰。

峰数小于理论振动数：①没有偶极矩变化的振动不产生红外吸收②相同频率的振动吸收重叠，即简并③仪器不能区别那些频率十分接近的振动，或因吸收带很弱，仪器不能检出④有些吸收带落在仪器的检测范围之外。

4．特征峰与相关峰：特征峰：有些官能团在某一区域出现吸收谱带，它的位置相对恒定，不受或少受分子中其他部分的影响，这种谱带称为相应官能团的特征峰，简称特征峰。

相关峰：在化合物的红外图谱中由于某个官能团的存在而出现的一组相互依存的特征峰，可互为相关峰，用以说明这些特征峰具有依存关系，并区别于非依存关系的其他特征峰。5．傅里叶变换红外光谱仪：扫描速度快光通量大分辨率高测定光谱范围宽等特点.其核心部位是迈克尔逊干涉仪；干涉仪的作用是将复色光变为干涉光。

第五章：色谱分析

纸色谱

1.定性与定量的方法：

（1）定性分析：样品经展开显色后，与柱色谱相似，物质在图谱上的位置可用Rf值表示：Rf=物质斑点移动的距离/ 溶剂前沿移动的距离=a / b

如同连续下降展开法，则没有溶剂前沿，此时可用某一种标准物质所移动的距离作为参照。例如糖类的纸色谱时，一葡萄糖所移动的距离为标准，用RG表示。

RG=糖的斑点（浓度中性）移动的距离/葡萄糖斑点（浓度中性）移动的距离=a/b

定性分析采用与标准样比R定性。

（2）定量分析：纸色谱的定量方法很多，但一般属于半定量法。

①斑点面积法②直接比色法③剪洗法

气相色谱

1.色谱仪：①气路系统②温度控制系统③检测器的配置部分④记录仪

2.最常用的通用性检测器：热导池检测器（TCD）、氢火焰离子化检测器（FID）；最常用的选择性检测器：火焰光度检测器（FPD）、电子捕获检测器（ECD）

3.固定液固定液一般为高沸点的有机物。

对固定液的要求：

最高使用温度高：在操作温度下蒸汽压低，热稳定性好，决定了最高使用温度。

最低使用温度低：在操作温度呈液态，而且黏度越低越好。物质在高粘度的固定液中传导速率慢，柱效率因而降低。

化学稳定性好：固定液与被分析物质及担体不发生化学反应，能牢固地附在载体上，并形成均匀和结构稳定的薄膜。

组分具有一定溶解度：为了使样品各组分分离，固定液对组分必须有一定的溶解度，不然组分就会很快被载气带走而不能在两相之间进行分配。

选择性强：对沸点相近的类型不同的物质有分离能力，既保留一种类型化合物的能力大于另一种类型。

固定液的选择：一般是从被分析物质与固定液分子间的作用力以及固定液的分类来作为选择固定液的依据。固定液的选择一般根据“相似相溶“规律，即固定液的性质与被分离物质之间有某些相似性，如官能团、化学键、极性、某些化学性质。

对担体的要求：化学惰性、比表面积较大，孔径分布均匀、热稳定性好、有一定机械强度4.几种常用的定量方法

归一化法：当样品各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示出色谱柱是，可用此方法进行定量计算。

内标法：当只要求测定样品试样中某几个组分，而试样中所有组分不能全部出峰时，可用此法。

外标法：取纯物质配置成一系列不同浓度的标准样，分别取一定体积注入色谱仪，得到色谱图，测出峰面积，作峰面积和浓度关系曲线，及标准曲线。然后再同样条件下，注入同样的未知试样，从色谱图上测出峰面积，由上述标准曲线查出被测组分的浓度。

毛细管色谱分析

1.特点：①容量小②渗透率高③柱效率和分离效率高

2.进样系统为什么采用分流装置？

由于毛细管柱容量很小，每次只允许进样0.01uL，所以要把这极微量样品，瞬间引入毛细管柱，一般必须使用分流法进样。

3.高效液相色谱与经典液相色谱法相比

①颗粒极细（一般为10μm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；

②高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；流速最高可达10cm3·min-1.

③高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10-9g，而荧光检测器最小检测限可达10-12g。

4.正、反相液相色谱

①亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。

②若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。

5.色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间或液体流出体积的曲线。

提高柱效能：A为涡流扩散项，A=2λ*dp，λ反映了色谱柱填充物的不规则因素和不均匀程度。dp为填充颗粒直径，仔细填充柱子并采用均一的载体，可以减少A项而提高柱效；B为自由分子扩散项，与流速成反比，在低流速下影响较大;C为传质阻力，在低流速下可以减小传质阻力，使用小颗粒载体也可以减小传质阻力而提高柱效。

第七章：免疫分析

1.抗原与抗体的概念：抗原是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质；抗体是指由机体对应于抗原的刺激产生的一类物质。

2.抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、最适比例性、反应的阶段性。

酶联免疫分析

1.酶联免疫分析法（ELISA）关键步骤：①包被技术：包被是ELISA技术的第一步，也是关键一步。它是将抗原或抗体与酶标板结合的过程。②封闭酶标反应孔：抗原或抗体包被后，酶标板上会剩余一些未结合位点。封闭的目的是将所有的这些位点全部和不影响定量的蛋白质结合，使其失去和后续步骤中其他反应试剂结合的能力。③洗涤：实验每一步之间都要洗涤，目的是除去未结合的物质，一般采用磷酸缓冲液加吐温20，洗涤要彻底，一般采用满孔洗涤3遍，每遍3min。现在有自动化的洗板机，可简化人工操作。④加入酶结合物：酶结合物一般为酶标第2抗体，可用酶标SPA作为通用酶结合物使用。

常用酶与底物的反应⑤结果判断⑥减少ELISA中的非特异吸附

2.常用酶与底物的反应

酶辣根过氧化酶底物邻苯二胺(OPD)+过氧化氢说明用硫酸终止反应光度测定碱性磷酸酶四甲基联苯胺（TMB）+过氧化氢4-硝基苯酚光度测定

葡萄糖氧化酶过氧化氢/色原体光度测定

β-半乳糖苷酶 2-硝基苯酚光度测定

放射免疫分析的表示：Ag+ + Ab→Ag0 - Ab

+Ag ↓

Ag - Ab

实验：

实验1：白酒中总酸含量测定

1、实验原理：白酒中的总酸以中和法直接测定，根据所消耗的碱液量计算出白酒中总酸的含量（白酒中总酸以乙酸计）

2、实验步骤：准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色。记录滴定体积。同时做空白试验。

实验2：白酒中总酯含量测定

1、实验原理：先用碱中和白酒中的游离酸，再加一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。

2、实验步骤：准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色（不可过量）。再准确加入25.0ml 0.1mol/L 氢氧化钠溶液，放置过夜皂化（或接上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化半小时），用0.1mol/L 盐酸溶液滴定至红色刚刚消失。记录盐酸溶液用量体积。

实验3：双缩脲比色法

1.原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在540nm处有最大吸收。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关。该法测定范围1~10mg蛋白质，适用于测定精度要求不高的样品。

实验4：紫外吸收法

1.原理：蛋白质分子中的络氨酸、色氨酸等残基在波长280nm处具有最大吸收峰。由于各种蛋白质都含有络氨酸，因此280nm处的光吸收是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm处的吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。核酸在紫外线区也有强吸收，可通过校正加以消除。

实验5：氨基酸自动分析仪法

1.原理：氨基酸自动分析仪是根据离子交换柱层析原理分离分析氨基酸的自动化分析仪器。离子交换柱层析使混合液中各种氨基酸的分离是靠两种因素综合作用的结果：

①氨基酸离子与离子交换树脂电离基团之间的静电吸引作用。这种作用随环境PH变化而变化。

②氨基酸的R基团与树脂的非极性苯环之间的疏水相互作用。R基团疏水性强者亲和力大，弱者亲和力小。

实验6：脂肪含量的测定

1.原理：脂肪经有机溶剂（乙醚，石油醚，氯仿等）抽提，蒸发有机溶剂，残渣即为脂肪。由于抽提中除脂肪外，游离脂肪酸，有机酸，树脂，色素等也同时被抽提，故测得结果称为粗脂肪。

2.实验步骤

1：样品预处理：称取样品的重量根据材料中脂肪的含量而定,通常脂肪含量在10％以下的，称取样品10-12克；脂肪含量为50-60％的，则称取样品2-4克，(可以用测定水分后的样品)。

将样品在80-100℃烘箱去水分。一般烘4小时，烘干时要避免过热。冷却后，准确地称取一定量样品，必要时，拌以精制海砂，无损地移入滤纸筒内，用脱脂棉塞严，将滤纸筒放人索氏提取器的提取管内，注意勿使滤纸筒高于提取管的虹吸部分。

2：抽取：将洗净的提取瓶在105℃烘箱内烘干至恒重,加乙醚约达到提取瓶容积的1/2～2/3，然后将提取器各部分连接，注意不能漏气。

加热提取时，应在电热恒温水浴中进行(水浴温度约为40-50℃)，严禁用火焰直接加热索氏提取器。

在加热时乙醚蒸发，乙醚蒸汽由连接管上升至冷凝器，凝结成液体滴入提取管中，此时样品内的脂肪为乙醚液面超过虹吸管高度后溶有脂肪的乙醚虹吸管流入提取瓶，循环抽提，调解水浴温度，使乙醚每小时循环3－5次，抽提时间视样品的性质而定，一般需6－12小时，样品含有脂肪是否提取完全，可以用滤纸来粗略判断，从提取管内吸取少量的乙醚并滴在净的滤纸上，待乙醚干后，滤纸上不留有油脂的半点则表示已经提取完全。

提取完全后，再将乙醚蒸到提取管内，待乙醚液面达到虹吸管的最高处以前，取下提取管。

3：称重和计算：将提取瓶中的乙醚全部蒸干，洗净外壁，置于105℃烘箱干燥至恒重，按下式计算样品的粗脂肪百分含量。粗脂肪含量(%)=(m2-m1)×100/m

式中：m—称取试样质量(g) m1—抽提瓶质量(g) m2—抽提瓶与粗脂肪质量(g)

实验7：还原糖的测定

1.原理：碱性酒石酸钾钠甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀

很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物，在加热条件下，以次甲基蓝作指示剂，用还原糖液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，进而与亚铁氰化钾反应生成可溶性的浅黄色亚铁氰化钾钠铜络合物。

待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖将次甲基蓝还原，溶液蓝色消失，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算出还原糖含量。

2.实验步骤

1．样品处理

(1)乳类、乳制品及含蛋白质的饮料称取2.5~5.0g固体样品或吸取25~50mL液体样品，置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌及5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置0.5h。用干燥滤纸过滤，收集滤液供测使用。

(2)酒精性饮料吸取100mL样品于蒸发皿中，用1mol/L NaOH中和至中性，在沸水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，加50mL水混匀，以后按(1)操作。

(3)含多量淀粉的食品称取10~20g样品，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45℃水浴中加热1h.振摇。取出冷却后加水至刻度，混匀，静置。吸取20mL上清液于另一250mL 容量瓶中，以后按(1)操作。

(4)汽水等含CO2饮料吸取100mL样品于蒸发皿中，在沸水浴中除去CO2，移入250mL 容量瓶，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶，加水至刻度，混合后备用。

2．碱性酒石酸铜溶液标定

吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中。加水10mL，从滴定管加约9mL标准转化糖，使其在2min内加热沸腾。准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴加转化糖标液，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，后滴定操作需在1min内完成，消耗糖液在1mL以内。记录消耗转化糖标液的总体积。

计算：10mL(甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量(mg)：F=V×ρ式中 F—10mL碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量(mg)

ρ—转化糖标准溶液的浓度(mg/mL)

V—标定时消耗转化糖标准溶液的总体积

3．(1)样品溶液预测定：吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，使其在2min内加热沸腾，准确沸腾30s，微沸下以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，待溶液蓝色变浅时，以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗体积。

(2)．样品溶液精测定：吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，从滴定管加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗总体积。

实验8：水分活度的测定（扩散法）

1原理：将试样置于康维bing中，分别和标准水分活度的饱和溶液扩散平衡后，根据试样质量变化值求得水分活度（Aw）

实验9：锌含量测定（双硫腙比色法）

1 原理：锌在酸性条件下（PH4—5）,与双硫腙生成红色络合物，经四氯化碳萃取后以比色法测定。

实验10：铁含量的测定（邻菲绕啉比色法）

1.原理：在弱酸性条件下，二价铁离子与邻菲绕啉生成红色络合物，比色法测定。

2.铁的其他比色方法：①硫氰酸比色法②氨基水杨酸比色法③

实验11：一般酶活力的测定

1.四个操作步骤：①对样品酶液进行适当稀释②进行酶促反应③测定反应量④计算酶活力

实验12：糖化酶活力测定

2.实验原理糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。糖化酶催化淀粉水解，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a—1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。

3.实验步骤(1）待测酶液的制备：称取酶粉1~2g，准确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸缓冲溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（酶液浓度在样品与空白消耗Na2S2O3的差值为3~6mL为宜），摇匀。通过四层纱布过滤，滤液供测定用。

(2）酶活力测定：于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入20g/L可溶性淀粉25mL和pH4.6乙酸缓冲液5ml,摇匀后至40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/L NaOH溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘溶液10mL，再加0.1mol/L NaOH溶液15mL，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L硫酸2mL，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。不同稀释倍数，应做相应的空白实验。

实验13：蛋白质的测定

1.实验原理

凯氏定氮法：含蛋白质样品经加硫酸、硫酸钾、硫酸铜等催化剂消化，使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。

消化：有机含氮物+H2SO4→CO2↑+SO2↑+H2O↑+NH3↑ 2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4

蒸馏：(NH4)2SO4+ 2NaOH → 2H2O+NaSO4+2 NH3↑

吸收： 2 NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5 H2O

滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

2.实验步骤

(1)消化：准确称取试样0.2~0.3g(含有10~30mg粗蛋白质)置入100mL凯氏烧瓶中，加混合催化剂1g，同时加硫酸—过氧化氢—水混合液3~5mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行了消化。开始用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅蓝色的透明状时，再继续加热沸腾10min,取出，冷却到室温后，将消化液转入100mL容量瓶中，用70~80mL水洗涤凯氏烧瓶，冷却至室温后加水稀释到刻度，摇匀。同时作一空白，除不加试样外，其它操作相同。

(2)蒸馏：在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入5mL稀释消化液和10mL水，再加入400g/L NaOH溶液，立即用水蒸气蒸馏，接收三角瓶中加20mL硼酸—指示剂混合液。待蒸馏沸腾后蒸馏至溶液呈亮绿色后再蒸馏5min。

(3)滴定：用0.01mol/L HCl标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液由亮绿色变成浅紫色为止。

吸取5mL空白消化液，按照上述步骤进行操作。