PCR和DNA测序解析
分子生物学常用技术(二)
分子生物学常用技术（二）引言概述:本文旨在介绍分子生物学中常用的技术，以帮助读者全面了解分子生物学研究的方法和工具。
本文将重点介绍分子生物学常用技术（二），包括基因克隆、PCR、DNA测序、基因编辑和蛋白质表达等。
正文:一、基因克隆1. 酶切与连接：通过使用特定限制酶对DNA进行切割，然后使用DNA连接酶将不同DNA片段连接起来。
2. DNA片段扩增：利用聚合酶链反应（PCR）扩增目标DNA片段，得到大量复制的目标片段。
3. 质粒构建：将目标基因片段插入质粒中，构建重组质粒，然后将其转化到宿主细菌中。
二、PCR1. 反应体系：PCR反应需要引物、模板DNA、琼脂糖等成分，同时需要在适宜的温度条件下进行。
2. 热循环：PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
通过不断重复这三个步骤，可以扩增目标DNA序列。
3. PCR变异：通过引入突变引物或特殊PCR反应体系，可以实现目标片段的定向变异。
三、DNA测序1. Sanger测序：利用DNA聚合酶反应合成，以dideoxynucleotide三磷酸（ddNTP）作为终止子，从而得到带有不同长度的DNA片段，再通过毛细管电泳分离，并借助荧光标记的ddNTP定序碱基。
2. 下一代测序：利用高通量测序平台，如Illumina、Ion Torrent等，可以同时测序大量DNA片段，从而加快和降低测序成本。
3. 新一代测序技术的应用：新一代测序技术广泛应用于基因组测序、转录组测序、甲基化测序等领域。
四、基因编辑1. CRISPR-Cas9系统：通过引入Cas9核酸酶和相应的单导RNA（sgRNA），可以实现对目标基因的精准编辑和改造。
2. CRISPR-Cas9应用：基因敲除、基因敲入、基因修饰和基因变异等应用广泛，可以用于研究基因功能和疾病治疗等领域。
3. CRISPR-Cas9技术的优缺点：CRISPR-Cas9技术具有高效、快速和精准编辑基因的优点，但也存在不确定的副作用，如非特异性剪切和细胞毒性等。
DNA测序的原理与应用
DNA测序的原理与应用DNA测序技术是生命科学研究中的重要手段之一，在基因组学、遗传疾病研究、进化生物学、医学诊断和治疗等领域有着广泛的应用。
本文将介绍DNA测序的原理和应用，以及目前常用的测序技术和分析方法。
一、DNA测序的原理DNA测序是指通过检测DNA分子中的碱基序列，确定DNA信息的过程，特别是确定基因组DNA的序列。
DNA测序技术的基本原理是二代测序技术，其主要流程包括DNA提取、文库构建、PCR扩增、芯片测序和数据分析等环节。
在这个过程中，DNA文库的构建、PCR扩增和芯片测序是关键的核心技术。
二、DNA测序的应用DNA测序技术在生命科学领域有着广泛的应用，其中包括基因组学、遗传疾病研究、进化生物学、医学诊断和治疗等方面。
1.基因组学和遗传疾病研究DNA测序技术的快速发展，使得人类和不同物种的基因组测序成为可能。
有了这些基因组数据，基因组学家和遗传学家们就能够更好地了解基因组组成，发现基因和基因座，研究基因调控和功能以及遗传病的发病机制。
2.进化生物学DNA测序技术也是进化生物学研究中不可或缺的工具。
通过对不同物种DNA序列的分析，可以推断出它们之间的演化关系。
同时，DNA测序技术也为研究物种多样性和进化历史提供了新的方法和工具。
3.医学诊断和治疗DNA测序技术在医学临床实践中也有广泛的应用。
现在越来越多的医院和医疗机构采用基因测序技术来检测遗传性疾病、肿瘤基因、药物代谢等，实现了个性化医疗的目标。
此外，生物技术公司也通过基因测序技术来开发更有效的药物和诊断工具。
三、DNA测序技术的发展DNA测序技术的发展经历了多个阶段。
从Sanger测序的手工操作到二代测序技术的高通量操作，再到三代测序技术的单分子测序，每一代测序技术都在不断进化，提高长度、质量、速度和成本等方面的性能。
1. Sanger测序20世纪70年代，Frederick Sanger和Alan Coulson发明了一种以上市场命名的测序技术—— Sanger测序。
dna检测的方法及原理
dna检测的方法及原理DNA检测是一种现代生物学研究和应用的重要手段，广泛应用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪侦查等领域。
本文将介绍DNA检测的常见方法及其原理。
一、聚合酶链反应（PCR）法PCR法是最常用的DNA检测方法之一，它能够快速扩增DNA样品，从而达到检测目的。
PCR法的原理基于DNA的复制过程，通过逐渐升高和降低温度，DNA模板可以被酶（聚合酶）复制成数百万个几乎完全相同的片段。
这种方法具有高效、灵敏和高度特异性的特点。
二、电泳法电泳法是将DNA样品置于电场中进行分离和检测的一种常见方法。
它是基于DNA带电的特性，通过电子的运动来实现DNA的分离。
DNA电泳法可以用来检测DNA片段的大小、浓度和纯度。
常用的电泳方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
三、核酸杂交法核酸杂交法是通过DNA或RNA片段的互补配对现象来对目标DNA进行检测的方法。
该方法基于DNA的碱基互补性原理，引入与目标DNA序列互补的探针，通过离子效应的形成标记产物进行检测。
核酸杂交法在病毒检测、基因突变检测等方面具有重要的应用价值。
四、DNA测序技术DNA测序技术是对DNA进行精确测序的方法，被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断等领域。
其中，Sanger测序法是最早被使用的DNA测序方法之一，通过利用DNA合成中的dNTP链终止作用来确定DNA序列。
而近年来兴起的下一代测序技术（NGS）则具有高通量、高速度和低成本的优势，使得大规模DNA测序成为可能。
五、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法PCR-RFLP法是一种结合了PCR法和限制性片段长度多态性分析的方法。
它通过PCR扩增特定DNA片段，然后利用限制酶对扩增产物进行酶切，观察切割产物的大小差异，从而判断目标DNA片段是否发生了突变。
PCR-RFLP法在疾病相关基因突变检测和亲子鉴定等方面有广泛应用。
六、单核苷酸多态性（SNP）分析SNP分析是通过检测DNA中的单核苷酸变异（即SNP）来进行个体差异分析和细菌学鉴定的一种方法。
生物学中的DNA复制检测技术
生物学中的DNA复制检测技术DNA是构成生物体的基本单位，是遗传信息的携带者。
DNA 复制是生命的基本过程，也是细胞分裂的前提条件。
但是，DNA 复制过程中会出现错误，这些错误也会传递到下一代细胞中，从而导致疾病的发生。
因此，准确地检测DNA复制过程中的错误是非常重要的。
本文就介绍当前生物学中的DNA复制检测技术。
一、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的DNA复制检测技术。
它利用DNA聚合酶的酶学特性对DNA进行复制。
PCR技术的优点是可以在非常短的时间内扩增任何特定的DNA序列，从而进行高灵敏度、高特异性的检测。
PCR技术的操作相对简单，只需要一些基本的实验室设备即可实现。
PCR技术主要应用于检测基因突变、DNA序列变异和病原微生物等。
二、测序技术测序技术是通过对DNA序列进行测定，来分析DNA复制时的错误。
测序技术的应用范围非常广泛，包括基因测序、基因变异检测、病原菌检测等。
最常用的测序技术是Sanger测序。
Sanger 测序是通过对DNA链的延伸和终止来确定DNA序列。
通过Sanger测序技术可以检测出DNA序列上的个别碱基发生的错配或缺失，进而发现某些疾病的基因突变等。
三、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，也被广泛应用于DNA复制检测。
CRISPR-Cas9技术基于细菌的天然免疫机制，借助于CRISPR序列和Cas蛋白来实现对DNA序列的定点切割和修复。
CRISPR-Cas9技术具有高效、灵活、快速等优点，并且可以实现对任何基因组的编辑和操作。
CRISPR-Cas9技术还可以实现对病原菌、肿瘤细胞等有害微生物和细胞的精确打击，具有极大的潜力。
综上所述，DNA复制的精确检测和分析是生物学中的一个重要方向。
当前，PCR、测序和CRISPR-Cas9技术都是应用广泛的DNA复制检测技术。
但是，这些技术也存在一些缺点，包括操作繁琐、费用高昂等。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理PCR测序是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的DNA测序方法。
其原理是通过PCR扩增DNA片段，然后将扩增产物进行测序，从而得到DNA序列信息。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
一、PCR扩增1.1 PCR反应体系PCR反应体系主要包括以下组分：模板DNA、引物、酶、缓冲液和dNTPs。
- 模板DNA：即待扩增的DNA片段。
- 引物：引物是一种短链寡核苷酸，通常由20个碱基左右组成，用于定向扩增目标DNA片段。
- 酶：PCR反应中使用的酶为聚合酶（polymerase），其作用是在每个循环中将单链模板DNA复制成双链DNA。
- 缓冲液：缓冲液用于调节反应体系的pH值和离子强度等参数，以确保反应能够顺利进行。
- dNTPs：即脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates），是构成新合成DNA链所需的四种单元之一。
1.2 PCR扩增过程PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
- 变性：在PCR反应开始时，将反应体系加热至94℃左右，使DNA 双链解开成两条单链。
- 退火：将温度降至引物的退火温度（通常为50-65℃），使引物与模板DNA结合成一个稳定的复合物。
- 延伸：将温度升高至聚合酶的最适工作温度（通常为72℃），聚合酶开始在引物的基础上扩增新的DNA链。
这个过程会一直持续到dNTPs用完或者达到设定的PCR循环次数。
1.3 PCR产物经过多轮PCR扩增后，可得到大量目标DNA片段。
这些产物可用于下一步的PCR测序。
二、PCR测序2.1 Sanger测序Sanger测序是最早被广泛使用的PCR测序方法。
其原理是通过在PCR反应中加入一种特殊的二进制核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）来终止新合成链的延伸，从而得到不同长度的DNA片段，并通过电泳分离出这些片段。
根据片段长度和ddNTP种类可以推断出DNA序列信息。
PCR技术的原理及应用
PCR技术的原理及应用PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种在体外扩增DNA分子的方法，可以快速、高效地制备大量的特定DNA序列。
PCR技术的原理主要包括三个步骤：变性、引物结合和DNA合成。
首先是变性步骤。
DNA双链会在高温（通常为94-98℃）下变性，即两条链分离成两条单链。
这一步的目的是断开氢键，使DNA分子完全解旋成单链，为下一步的引物结合提供条件。
接下来是引物结合步骤。
在降温到50-65℃的温度下，引物会结合到单链DNA上的互补序列上。
引物是两端能够与目标序列互补配对的短链DNA分子，通常由实验者设计合成。
引物结合的位置取决于目标DNA序列的两端，这两个位置是实验者在设计引物时需要仔细考虑的。
引物结合完成后，可以通过温度升高将引物与模板DNA分离。
最后是DNA合成步骤。
在70-75℃的温度下，引物就位后，酶Taq DNA聚合酶会在模板DNA上合成新的DNA链。
Taq DNA聚合酶是特殊的热稳定酶，能够耐受高温，因此可以在高温下工作。
合成的DNA链以双链DNA的形式存在，成为新的模板DNA，重复上述步骤，即可实现DNA的指数级扩增。
1.分子诊断：PCR可以用于检测和诊断疾病，如感染病毒、细菌等。
例如，通过设计特异引物，PCR可以快速检测是否患有COVID-19病毒。
2.基因克隆：PCR可以用于检测和扩增目标DNA序列，从而进行基因克隆。
在基因工程中，通过PCR技术可以扩增目标基因，然后将其插入到载体中进行进一步研究。
3.DNA测序：PCR可以用于扩增目标DNA片段，然后进行测序。
PCR 测序是测序技术中的一种常用方法，可以用于测序新发现的基因序列或研究特定目标基因的序列。
4.基因表达分析：PCR可以用于检测和量化基因的表达水平。
通过设计特异引物，可以扩增目标基因的cDNA，然后通过定量PCR等方法可以分析基因的表达水平。
5.遗传多态性研究：PCR可以用于检测和分析不同个体之间的遗传多态性。
PCR技术及测序
pcr技术的发展历程
1983年
Kary Mullis首次提出PCR技术的基本 原理。
1985年
Mullis和Cetus公司合作，实现了第一 次成功的PCR实验。
1987年
美国PE-Cetus公司推出了商业化PCR 仪，使PCR技术开始广泛应用于生命 科学研究领域。
1990年
美国PE-Cetus公司推出第一台自动 PCR仪。
测序分析
对PCR产物进行测序，获得目标基因的序列信息。
结果解读
对测序结果进行解读，分析基因变异、表达水平等信息。
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测序分析
对纯化的产物进行测序分析，以确定其序列。
结果解读
对测序结果进行解读，分析其与已知序列的 相似性和差异性。
04 测序技术概述
测序技术的定义
测序技术是指通过一定的方法测定生 物体内核酸的碱基排列顺序，从而分 析其基因型的过程。
测序技术是基因组学、遗传学和生物 信息学等领域的重要工具，对于生命 科学研究、医学诊断和治疗等方面具 有重要意义。
pcr技术及测序
目录
• pcr技术概述 • pcr技术的基本原理 • pcr技术的操作流程 • 测序技术概述 • 测序技术的基本原理 • 测序技术的操作流程
01 pcr技术概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pcr技术的定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA片段 的核酸扩增技术，通过DNA聚合酶的催化，将模板DNA在一定 温度下进行变性、退火和延伸，完成DNA的扩增。
测序技术的反应过程
模板准备
提取待测DNA，进行纯化处理，获得高质量的模板。
引物设计
DNA测序技术原理：基因组中的碱基序列分析
DNA测序技术原理：基因组中的碱基序列分析DNA测序是分析基因组中的碱基序列的技术，它的原理基于化学、生物学和计算机科学的多学科知识。
以下是DNA测序技术的基本原理：1. 样本准备：DNA测序的第一步是准备DNA样本。
样本可以来自生物体的细胞，可以是整个基因组的DNA，也可以是特定基因的DNA。
2. DNA复制：DNA样本中的DNA链被复制，以产生更多的DNA。
这通常通过PCR （聚合酶链式反应）或其他放大技术来完成。
3. DNA片段化：复制的DNA链被切割成短片段，通常长度在几百到几千碱基对之间。
4. 测序反应：使用测序反应来确定每个DNA片段的碱基序列。
目前有多种不同的测序技术，包括Sanger测序、Next-Generation Sequencing（NGS）等。
5. Sanger测序原理：反应体系： Sanger测序使用一种特殊的DNA聚合酶、DNA引物、四种不同的荧光标记的二进制核苷酸和可终止DNA链合成的二进制核苷酸（dideoxynucleotide）。
合成终止：在DNA合成的过程中，如果在新合成链上加入了带有荧光标记的dideoxynucleotide，DNA链的生长就会终止。
分离与检测：反应产物通过凝胶电泳分离，然后使用荧光检测器检测荧光标记的终止核苷酸，从而确定DNA链的碱基序列。
6. Next-Generation Sequencing（NGS）原理：并行测序： NGS技术允许同时测序许多DNA片段，通过并行处理大量的DNA序列信息。
荧光标记： DNA片段被标记，然后通过光学或电化学方法进行测量。
数据分析：通过计算机进行大规模的数据分析，将碱基序列的信息还原出来。
7. 数据分析与装配：通过计算机对得到的测序数据进行分析，将碱基序列还原成原始DNA序列。
这包括去除杂音、纠正测序错误和对碱基进行准确的排序。
8. 结果解读：最后，通过生物信息学工具和数据库比对，对DNA序列进行解读，找到基因、调查变异或识别其他生物学信息。
pcr测序原理
pcr测序原理1. 引言PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA的特定片段。
PCR测序是一种基于PCR 技术的DNA测序方法，它通过PCR扩增出的DNA片段来确定DNA 序列。
本文将深入探讨PCR测序的原理及其在基因组研究中的应用。
2. PCR测序原理PCR测序是一种无模板法的测序方法，它利用PCR扩增DNA片段，然后通过测序仪器对扩增的片段进行测序。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
2.1 PCR扩增需要设计一对引物，引物的序列应该与待扩增片段的两端序列匹配。
PCR反应涉及到三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将待扩增的双链DNA加热至95°C，使其变性成两条单链DNA。
将反应体系温度降低至55-65°C，引物与目标片段的互补序列进行配对，这一步骤称为退火。
在72°C的延伸步骤中，分别使用DNA聚合酶和四种核苷酸（dNTPs）扩增新的DNA链，形成DNA扩增产物。
2.2 扩增产物纯化在PCR反应结束后，扩增产物需要进行纯化。
纯化的目的是去除杂质和剩余的引物、核苷酸和酶等。
纯化的方法通常包括酶处理、柱层析或凝胶电泳等。
纯化后的扩增产物可以被用于后续的PCR测序实验。
2.3 PCR测序PCR测序需要使用测序仪器，测序仪器可以检测到每个扩增产物的碱基序列。
通常使用有效的荧光标记dideoxynucleotides（ddNTPs）来标记链终止。
在测序反应中，扩增产物会与引物和ddNTPs一起放入测序仪器中。
随着延伸的进行，当ddNTPs加入到新合成链中时，DNA链的扩增会终止。
由于每种ddNTPs都有不同的荧光标记，测序仪器会同时监测DNA链扩增的终止情况和发出的荧光信号，从而确定DNA序列。
3. PCR测序的应用PCR测序在基因组研究中有着广泛的应用。
下面将介绍PCR测序在以下几个方面的应用：3.1 基因突变检测PCR测序可以用于检测基因组中的突变，从而帮助研究人员了解突变与疾病之间的关系。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的DNA分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增DNA片段，是许多分子生物学实验的基础。
PCR测序是利用PCR技术对DNA片段进行扩增，并通过测序方法确定DNA序列的过程。
本文将重点介绍PCR测序的原理及其在实验中的应用。
首先，PCR测序需要进行PCR扩增反应。
PCR扩增是通过DNA聚合酶酶和引物（primers）的作用，在一定的温度条件下，对DNA片段进行多轮扩增的过程。
在PCR扩增反应中，引物将与目标DNA序列特异性结合，DNA聚合酶酶则在引物的引导下合成新的DNA链。
经过多轮循环，目标DNA片段将得到显著的扩增。
在PCR扩增反应完成后，接下来就是进行测序。
PCR测序主要有Sanger测序和Next Generation Sequencing（NGS）两种方法。
Sanger测序是第一代测序技术，它利用特殊的二进制缺失核苷酸，将DNA合成链随机终止，从而得到DNA序列信息。
而NGS则是一种高通量测序技术，能够同时对大量的DNA片段进行测序，大大提高了测序的效率。
在Sanger测序中，PCR扩增得到的DNA片段将被用作测序模板。
首先，将DNA片段与引物和特殊的二进制缺失核苷酸一起进行反应，DNA聚合酶将在缺失核苷酸的位置停止合成新的DNA链。
通过对反应产物进行电泳分离，就可以确定DNA序列信息。
而在NGS中，PCR扩增得到的DNA片段将被连接到芯片或固相支持上，形成文库。
接下来，通过特定的测序仪器对文库中的DNA片段进行测序，从而得到大量的DNA序列信息。
总的来说，PCR测序是一种快速、准确的DNA测序方法，广泛应用于基因组学、疾病诊断、药物研发等领域。
通过PCR扩增和测序技术，我们可以快速获取目标DNA片段的序列信息，为科研和临床实践提供了重要的技术支持。
在实验中，PCR测序需要严格控制反应条件和引物设计，以确保扩增和测序的准确性。
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量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率>>DNA 自身复性 几率 ）;
引物的最佳退火温度Tm-5 ℃，引物的量 引物的长度
3)引物的延伸（新链DNA的合成）
70℃~75 ℃，30~60s （<2kb)
2.标准体系：常选用20~100ul体系
模板核酸（template如：人基因组DNA 0.1ug) 扩增引物（primer一对,各0.25umol/L） TaqDNA聚合酶（2.5U） dNTP（四种：各200umol/L) 标准缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或明胶） 无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油:30-50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）
聚合酶，其活性需要Mg2+ 。 但Taq-DNA聚合酶有一定错配率（无3’→5’外切酶活性，有5’→3’ 外切酶活性），为0.1%-0.25%（30次cycle）；若要细胞克隆PCR 扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用
c. 其他聚合酶
Characteristics of Taq Polymerase
Thermotolerance
No No Yes Yes Yes Yes Yes
常用的PCR技术
热启动PCR TD-PCR(touch down PCR,TD-PCR) 巢式PCR 反向PCR 锚定PCR 荧光定量PCR RT-PCR 不对称PCR
1、热启动PCR
4)循环次数的设定
主要取决于最初靶分子的浓度
如：3x105、1.5x104、1x103、 50 copy 25~30、 30~35、 35~40、40~45cycle
过多的循环次数会增加非特异性扩增和碱基错配数；
平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式 的增加； 产生原因：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例 相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后变性不完 全而影响引物延伸
PCR的第1和2个循环过程
PCR的第3个循环过程
PCR
PCR技术的使用
PCR的标准反应程序：
变性-复性-延伸
1)DNA模板的解链（变性）
90 ℃~95 ℃，30s 理论上，在90℃左右能使DNA双链之间的 所有氢键链断开，完全分离为单链； 且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很 好保存
2)DNA 单链与引物的退火（复性）
8)引物的3’端一定要与模板配对
（特异性，引发延伸的点），以引物3’端A影响最大； 末端最佳选择为G 和C； 引物3’端不要是编码密码子的第3个碱基，密码子的简并性会影响扩增特异性
9)引物的5’端可以修饰：包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地
高辛等标记，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。
热启动PCR（hot start PCR） 一种改良的PCR方法 有效避免非特异性扩增 方法： 退火之前，将DNA聚合酶与其他反应物隔绝 或者使用在高热状况下才会活化的聚合酶2、 NhomakorabeaD-PCR
用途：富集特异性产物 Touchdown PCR，降落PCR。 退火温度常起始在高于计算的Tm值15℃左右， 每一或n个循环降低1℃（或n℃）退火温度， 直至达到一个较低的退火温度（常在Tm值以下 5℃ ）。 以此温度进行10多个循环。
温度 （℃）
循环1
94
循环2
循环3
94℃变性 （1min）
72 60
72 ℃延伸 60 ℃退火 （1.5min）
（1min）
PCR反应的温度循环周期
时间 （min）
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、 引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定 的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行， 直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成 引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不一
第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末 端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点
N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物 的序列是介于两种引物5’端之间的区域 引物本身也是新生DNA链的一部分 (10kb----15min)
(2)引物（寡核苷酸引物）
a.引物的作用：定位、定向、定范围，引物决定PCR扩增产物的
特异性与长度，引物设计决定PCR反应的成败。
b.引物的设计原则 1)长度
16-30bp ，一对引物。 过短—非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增， 从而降低扩增的灵敏性； 过长—易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延伸温度超过Taq酶的最适 温度，同时还使检测成本增加。 ℃以上。
3、巢式PCR Nested PCR
两套PCR引物 （巢式引物） 两轮PCR扩增
4、反向PCR
普通PCR只能扩增两端序列已知的基因片段， 反向PCR则可扩增中间一段序列已知，而两端序列 未知的基因片段
5、锚定PCR
锚地PCR技术是 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知 序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知 的序列作为引物进行PCR扩增。
/v_show/id_XMTU2NDg1MDQ0.html
1985年， Saiki等在《science》上详细描述（人珠蛋白DNA） 1988年 耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把 PCR推向了实用 阶 段，成为PCR发展史上又一里程碑
1989年，美国专利局授予PCR技术专利； PCR技术被《science》杂志评选为伟大的技术发明； 1989年为DNA聚合酶的分/子年
PCR循环：一个热变性-复性-延伸的过程。 通常，20-30个循环之后，可获得大约106倍待扩增的DNA片段的 拷贝。
DNA在细胞内的复制过程a
DNA在细胞内的复制过程b
DNA在细胞内的复制过程c
DNA复制过程中,2条新生链都只能从5端向3端延伸, 前导链连续合成,滞后链分段合成.
DNA在细胞内的复制过程d
5‘ RACE 和 3'RACE的原理不一样
Takara公司3' RACE和 5' RACE 试剂盒原理
3’RACE的局限性及注意事项
3’末端RACE相对容易，因为存在一个poly(A)，而且降解常 不是从3末端开始的。
c.引物的浓度：
0.1-0.5umol/L；引物：模板=108：1。 过低：将导致扩增效率下降； 过高：导致异位引导而使扩增的特异性下降。 对称PCR：二个引物的浓度相等； 不对称PCR：二个引物的浓度为50:1或100:1
d.引物的退火温度:（决定产物的特异性）
引物本身的实际变性温度-5(25)℃,55℃开始。
3. 影响PCR反应的因素 ( 最适条件）
(1)模板：将要被复制的核酸片段 DNA或RNA（RNA→cDNA） 较高的纯度：最好用纯化的DNA样品，
（避免混有蛋白酶、核酸酶）。 用量合适：102–105分子数（<100ng） （提高产量，减少非特异性扩增）； 线性DNA分子：环状DNA复性太快
以RNA（cDNA）为模板：（逆转录PCR） 变性温度及时间：94℃，30s 过长：酶活性降低 过短：解链不完全
1993年，Mullis 获得诺贝尔化学奖。 1993年至今： 计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程 序，使之迅速得到推广。 PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑， 巨大的推动作用。
什么是PCR ?
类似DNA在细胞内的复制过程: 由一对引物介导,通过温度调节，使双链DNA变成单链（变性）； 单链DNA能与引物复性（退火）成为 引物-DNA单链复合物； 在dNTPs存在下，DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA（延伸）
DNA在细胞内的复制过程e
1.PCR的基本原理
在离心管中进行的DNA合成扩增技术， 模拟染色体的体内复制过程； 与体内DNA复制的不同之处：
◇ ◇ ◇ ◇
耐热的Taq酶取代普通的DNA聚合酶 用合成的DNA引物替代DNA引物 温度的调节：变性、退火、延伸 反复循环，可使DNA无限扩增
PCR的第1个循环过程
PCR和DNA测序技术
Polymerase Chain Reaction
(PCR，多聚酶链式反应)
特异片断的体外扩增技术
无细胞克隆技术
(“free bacteria” cloning technique）
发展历程
1983年，由Cetus 公司的Kary Mullis 建立 /
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃ 150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55
3)碱基的随机分布：不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。 4)引物自身不存在互补碱基（连续互补少于3bp)，防止二聚体产生 5)一对引物间不应互补（连续互补少于4bp)，尤其是它们的3’端不应互补。
6)引物的纯度要高。
7)引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个 互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。
e.引物的延伸温度与时间
温度：68-72℃，温度主要取决于所用DNA聚合酶的最适温度。 时间：30-60s，决定于靶序列的长度，以及延伸温度。 72℃时的核苷酸掺入率：30-100bp/s，即1min：>2kb。