葡聚糖凝胶 LH-20使用说明(恒辉)
葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得
问：分得效果不是很好，上了有 8 毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用 约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差 不多，很让人困惑，郁闷。
了 1g 干态的,Sephadex LH20 对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品 在最佳配比的容液中溶呢?"
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说 的是 Sephadex LH20 不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是 Sephadex LH20 这种填料的特点:"洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合 物，可洗脱 5 个保留体积",
3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积 的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进 行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头 部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少 体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
当然有影响,Sephadex LH20 在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何 填料都是这样,只是 Sephadex LH20 很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收 缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱 溶剂对 Sephadex LH20 的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举
LH-20使用说明书
葡聚糖凝胶LH-20使用说明
适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。
因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。
上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，可大；差异小，应小。
凝胶过滤的上样量一般为6－8％的床体积，我们建议初次上样量控制在3％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
（见附表“溶剂混溶性”）
流动相的常用溶剂为：
水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加）。
使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态装柱，动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用的流动相体系平衡、上样
LH-20在不同溶剂中的溶胀性能：
溶剂混溶性表。
葡聚糖凝胶操作方法
【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
葡聚糖凝胶 LH-20使用说明书
葡聚糖凝胶LH-20使用说明书货号：S8111规格：25g/50g/100g保存：室温存储产品简介：适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。
可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子，因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，重复使用分离效果可保持不变。
上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。
凝胶过滤的上样量一般为5-7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关——难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
流动相的常用溶剂为：水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷。
这些溶剂的极性依次降低，对极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。
溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常在被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。
甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离适用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。
LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
使用说明：1葡聚糖凝胶LH-20的原理葡聚糖凝胶LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，主要靠凝胶过滤作用来分离。
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。
(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法一、准备工作：1.准备好葡聚糖凝胶柱和所需的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷缓冲液）等。
2.将葡聚糖凝胶柱放入柱层析设备中，并根据设备的要求进行调整和固定。
3.预冲柱层析设备和葡聚糖凝胶柱，以去除可能的污染和杂质。
二、样品处理：1.将待纯化的生物大分子样品先进行预处理，如去除悬浮物、离心沉淀等。
2.将样品溶液以适当的缓冲液进行稀释，以达到最佳的样品浓度和适合葡聚糖凝胶柱操作的样品体积。
三、样品加载：1.将处理好的样品溶液缓慢地倒入柱顶，让样品从柱顶进入柱内。
避免产生气泡。
2.分子在葡聚糖凝胶柱中会根据分子大小和亲疏水性质的不同而发生分离和吸附。
较大分子会在柱上层析，而较小分子会透过凝胶层均匀流出。
因此，样品会在柱内逐渐被分离和纯化。
四、缓冲液流动：1.样品完成加载后，使用适当的缓冲液进行柱洗涤，以洗掉非特异结合的杂质。
2.缓冲液的选择应根据样品的性质而定，具体的选择和流动条件可以参考相关的文献或经验。
五、洗脱纯化：1.在用于洗脱纯化的缓冲液中，调整适当的条件以实现目标分子的洗脱。
如调整pH值、离子浓度、添加洗脱剂等。
2.根据分子的亲疏水性质，选择适当的缓冲液浓度梯度进行洗脱。
一般来说，较强亲疏水性的分子需要更高浓度的洗脱缓冲液。
六、收集洗脱液：1.将洗脱液通过柱底收集，收集不同时间点或不同分析目的的洗脱液。
2.根据实验需要，将洗脱液分为不同部分进行后续的分析或纯化处理。
七、重复使用：1.柱层析后，葡聚糖凝胶柱可以进行再生，以重复使用。
具体的再生方法可以参考柱层析设备和葡聚糖凝胶柱的说明书。
总结：葡聚糖凝胶柱是一种常用的生物大分子纯化方法，通过分子在柱内的分离和纯化来实现样品纯化的目的。
使用葡聚糖凝胶柱时，需要根据样品的特性和需求进行适当的样品处理、缓冲液选择、洗脱纯化条件的优化等。
如操作规范且配合适当的实验条件，葡聚糖凝胶柱可以快速、高效地纯化和富集生物大分子。
LH-20介绍及应用
Sephadex LH-20
国内其它厂家生产的LH-20
FunctiontestforLH20drum201:1_UV1_254nm FunctiontestforLH20drum201:1_UV2_280nm mAU
在Sephadex LH-20 上的分离 p193
Sephadex LH-20 纯化植物激素及 蛋 白抑制剂
可利用Sephadex LH-20 分离细胞分裂素、脱落酸 和生长素。 可利用Sephadex LH-20 分离出几丁质酶的抑制剂 Psmmaplin A,它是一种酪氨酸的衍生物。 Shigeo Suzuki 从海底真菌TUF139中分离出抑制微 管蛋白组装的抑制剂，为脂肪酸的混合物。
•Sephadex LH-20 纯化黄酮及黄酮苷
5m柱 甲醇
槲皮素 Quercetin
山奈酚 Kaempferol
2m柱 甲醇
橙皮素 Hesperetin
几种黄酮类物质的分离 （上图：1. 芹菜苷配基 2. 漆黄素 3山萘酚） （下图：1.橙皮素 2.山萘酚 3. 槲皮素）
LH-20 应用：黄酮类化合物
葛根素 Puerarin
前处理后的葛根素半成品在 不同乙醇浓度的层析比较
左图：70%乙醇洗脱
右图：100%乙醇洗脱
前处理后的葛根素半成品1ml Q HiTrap 上的层析结果
•葛根素 •↙
Q柱后葛根素样品在LH-20柱上的层 析结果
•↙ 葛根素
Sephadex LH20纯化大豆异黄酮
大豆异 黄酮
Sephadex LH-20的的溶剂系统
Sephadex LH-20常选用单一的溶剂系统，应 用最多的是极性强弱不同的如下五种： 1、水； 2、甲醇； 3、丙酮； 4、乙酸乙脂 5、二氯甲烷 根据溶剂极性的不同，样品分别发生正相或 反相分配作用。 预试验时推荐使用40cm长层析柱。然后根据 预试时样品峰的分离情况，加长层析柱进行进 一步的分离。一般水、甲醇、丙酮为流动相 时，由于其洗脱能力强，柱长常使用5m；而 二氯甲烷、乙酸乙脂则更多地使用1m柱进行 分离。 优点：单一溶剂系统有利于溶剂系统的回 收。
Sephadex LH-20
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20堵啦，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1)选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。
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如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－ 水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，造成不必要的浪费）。如果 样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇 溶解，过滤后，湿法上样。
1. 葡聚糖凝胶 LH-20 的原理。
葡聚糖凝胶 LH-20 的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配 的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱 下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20 对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的 化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
上样的上样量一般为 5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在 1－2％的床体 积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱 高和流速控制；流动相可参考 TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时 间。
2. 葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂。
葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂 洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用 100％甲醇冲 柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用 50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例， 最后用 100％甲醇冲柱。
4. 葡聚糖凝胶 LH-20 的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在葡聚糖凝胶 LH-20 使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品 须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的 系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小 时打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。 (5) 洗脱：控制流速，一般 1drop/s 以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很 多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。 再生以备下次使用。
流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同 理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性 溶剂中明显收缩）。
溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常对被分离物质间的极 性和碱性差异比较小时采用。
葡聚糖凝胶 LH-20
使用说明
适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济 的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯 化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考 略几种色谱的作用机制。
最高载量可达 250mg 样品/ml 凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。
甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
使用方法：将干粉浸泡于 60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物， 抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱 体积的 60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两 个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并 根据性质确定柱高.如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。