110基础生物化学实验@中科大_实验三 葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２） （≥１）
Ｖ２、Ｖ１，是两种被分离物的洗脱体积 W１、W２，是两个物质的洗脱峰的宽度。两个相的物质要想完 全分离，ρ≥１。
实验材料与器材
胰蛋白酶（分子量为23KD）和牛血 清白蛋白（分子量68KD）混合物、层析 柱50cm×l.lcm、核蛋检测仪、部分收集 器、sephadex G一l50
实验步骤
1．凝胶的处理：取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液 （本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充 分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破 碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加 热至将近1OO℃，还可以排除凝胶内部的 汽泡。
Hale Waihona Puke 2．装柱：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓 冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左 右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上 清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次 性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶 后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加 盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实 验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱 床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是 否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理 实验材料与器材 实验步骤
实验原理
凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为 载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，各物质 在柱中存在两种运动，一是随洗脱液垂直向下移动，二是无 定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子，不能进人胶 粒内部，便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出，称为全排出)；小 分子物质，直径小于凝胶孔径，能自由进出能容纳下它们的 孔穴，绕道而行，结果在柱中的保留时间增长而最后流出;中 等大小的分子，能进人部分胶粒内部，从而在柱中的保留时 间较大分子长，但较小分子短，中间流出。于是，流过凝胶 柱的混合物按其分子大小W被分离。
实验三 凝胶过滤法分离蛋白质
实验三凝胶过滤法分离蛋白质【实验目的】了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
【基本原理】凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。
目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。
这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。
当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。
凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。
凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。
在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。
为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。
【实验试剂、材料和器材】（一）试剂（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
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实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。
葡聚糖凝胶层析试验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶（Gel）层析法的基本原理;2、掌握葡聚糖凝胶（SephadeX）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）;而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤 1 、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将 1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层 析柱中加入3-4ml 的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管 插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始 洗脱收集。
4、样品的检测酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在 测检测。
五、实验结果及分析 1、实验结果:2、蛋白质样品洗脱曲线:收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200 a I 到280nm 下收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为, 则计算：流速二每管体积/每管时间=3二min。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理
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实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
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2.3、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。 当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部， 流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内 部，流程短，流动快。分子量大小不同的多种 成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排 队”，凝胶表现分子筛效应。
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
4.3、上样：
上样前柱子要平衡。 打开上接头，用吸管吸去床面上大部分洗脱液， 当洗脱液面接近凝胶床面时，关闭层析柱出口 端，用吸管吸取样品混合液0.4毫升，沿管壁 小心加样于柱床表面，打开层析柱出口端，待 样品完全掺入胶内，开始收集流出液，同时小 心加满洗脱液，连接好层析柱上接头，通过泵 控制流速：1ml/min。 样品中组分的分子量差异特别大，颜色也不一样， 可使同学们直观地观察到层析分离过程。
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。 Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi 几个特征Kd值意义： ①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻； ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入； ③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入； ④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ，如某些芳香族化 合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25对它 们有吸附作用。
4.4、洗脱和收集：
流速1ml/min不变，3ml/tube收集流出液， 核酸蛋白检测仪的灵敏度定在0.2，记录 仪纸速6cm/h，电压50mV，部分收集器： 3min/tube。
最后，根据记录的实验结果，计算层析 柱的Vo、Vi以及样品的Ve、Kd。
雁过无痕 整ห้องสมุดไป่ตู้发布
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目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名 为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品 名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各 种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CMSephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖 （DEAE- Sephadex）等种类。
交联葡聚糖凝胶 ：
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
②装柱： 干净的层析柱调整固定在垂直状态，柱内装放 适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡， 关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液， 加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流 速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层 析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层 析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液。 调节流速1ml/min。床面上覆盖尼龙膜或滤纸 （对操作熟练者不需要而且不放更好）。
2.4、影响凝胶层析分离的因素：
2.4.1、样品的体积、粘度； 2.4.2、层析柱 ； 2.4.3、洗脱液流速的影响 ； 2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响。
2.4.1、样品的体积、粘度：
分析分离时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 样品液粘度与洗脱液粘度的比值。 分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。 今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积。
2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用； 酸性组分应选用偏碱性洗脱液； 碱性组分应选用偏酸性洗脱液。
2.5、凝胶层析法的应用：
1、生物分子的分离提纯； 2、测定高分子物质的分子量 ； 3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ； 5、用于去除热原物质 。
2.6、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质， 易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中 加入抑菌剂，使用时再除去。 常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1厘米光程时，254nm处透光率为60％， 280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp 上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。 3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分 收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。
实验二、葡聚糖凝胶柱层析
1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
2、概述及原理：
凝胶 是一类不溶于水，在水中却有 较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有 立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂 糖、聚丙烯酰胺等）。
2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：
是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析 凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨 架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通 过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分 子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三 维空间网状结构
2.2、不同型号的葡聚糖凝胶 (Sephadex) 的选用原则：
组别分离时，Sephadex G－25最为常用。例如 样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐 ； 分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯 化），应根据待分离样品中各组分的分子量 大小和分子量分布范围来确定型号。
4、实验操作过程：
4.1、凝胶的溶胀 4.2、装柱； 4.3、上样； 4.4、洗脱和收集。
4.1、凝胶的溶胀：
将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适 量洗脱液，沸水浴溶胀2小时（也可室温 24小时）。 沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒， 驱除凝胶颗粒内部的气泡。
4.2、装柱：
①流程：
4.2、装柱：
2.4.2、层析柱：
①柱长：组别分离时，20－30厘米； 分级分离时，可长至100厘米； ②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱 盐)，20:1─100:1 (纯化) 。 今天选用的是1cm ×30cm的层析柱。
2.4.3、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。 今天洗脱流速控制在1ml/min。