细胞融合操作规程1
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。
生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。
细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。
在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。
在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。
实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。
我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。
由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。
编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
动物细胞核移植的流程
动物细胞核移植的流程
细胞核的采集和卵母细胞的准备：从供体身体的某一部位上取体细胞，并通过体细胞培养技术对该体细胞进行增殖。
采集卵母细胞，体外培养到减数第二次分裂中期，通过显微操作去除卵母细胞中的核，由于减二中期细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管可以一并吸出细胞核和第一极体。
细胞促融：将供体细胞注入去核卵母细胞，然后通过电刺激使两细胞融合，供体细胞进入受体卵母细胞内构建重组胚胎，通过物理或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。
细胞融合实验报告
细胞融合实验报告
本实验旨在探究细胞融合对细胞生长和功能的影响，为了达到这一目的，我们进行了一系列的实验操作和数据分析。
在实验中，我们选取了两种不同类型的细胞进行融合，并观察了融合细胞的形态特征、生长情况以及功能表现。
首先，我们以显微镜观察了融合细胞的形态特征。
结果显示，融合细胞的形态呈现出明显的异质性，既有细胞A的特征，也有细胞B的特征，这表明细胞融合后细胞的形态会发生明显的改变，产生新的细胞类型。
其次，我们进行了细胞生长曲线的测定。
通过对融合细胞和单一细胞的生长情况进行比较，我们发现融合细胞的生长速度明显快于单一细胞，这说明细胞融合可以促进细胞的生长和增殖。
随后，我们对融合细胞的功能进行了评估。
实验结果显示，融合细胞在某些功能上表现出了明显的增强，例如对外界刺激的响应能力和分泌功能。
这表明细胞融合可以提高细胞的功能表现，使其具有更强的适应能力和生存竞争力。
最后，我们对融合细胞进行了基因表达谱的分析。
结果显示，融合细胞的基因表达谱发生了明显的改变，一些基因的表达水平显著上调或下调，这说明细胞融合会引起基因表达的重新编程，从而影响细胞的功能和特性。
综上所述，本实验结果表明，细胞融合对细胞的形态、生长和功能都产生了明显的影响，这为我们进一步探究细胞融合的机制和应用提供了重要的实验依据。
希望通过我们的努力，能够为细胞融合领域的研究和应用做出更多的贡献。
电融合仪操作手册
Multiporator®电转化仪使用说明书目录1 简介 (1)2 应用范围 (1)3 安全警示 (1)4 仪器介绍4.1 包装 (2)4.2 开始………………………………………………………………………………4.3 电击杯插槽……………………………………………………………………4.4 键区………………………………………………………………………………4.5 键及键组合………………………………………………………………………4.6 屏幕显示…………………………………………………………………………4.7 真核细胞和细菌／酵母的电转化………………………………………………4.7.1 连接外接电极（电转化/电融合）插件……………………………………4.8 细胞融合（可选择）……………………………………………………………4.8.1 优化细胞融合（镜下监测）………………………………………………4.8.2 清洗微融合杯………………………………………………………………4.8.3 螺旋融合杯…………………………………………………………………4.8.4 螺旋融合杯的上样及置入…………………………………………………4.8.5 融合及细胞悬液提取…………………………………………………………4.8.6 螺旋融合杯的清洗和消毒…………………………………………………4.9 打印连接／打印机（可选择）…………………………………………………5 操作模式5.1 真核细胞模式……………………………………………………………………5.2 细菌和酵母模式（可选择）……………………………………………………5.3 细胞融合模式（可选择）………………………………………………………5.3.1 功能：细胞排列………………………………………………………………5.3.2 细胞融合步骤…………………………………………………………………6 错误提示……………………………………………………………………………7 仪器的维护7.1 消毒………………………………………………………………………………7.2 清洗………………………………………………………………………………8 技术数据……………………………………………………………………………9 订购信息…………………………………………………………………………1 简介Multiporator®为真核细胞的电转染而设计，因为由有多种模式可选，也可进行细胞融合实验以及细菌和酵母的电转实验。
细胞电融合电穿孔仪安全操作及保养规程
细胞电融合电穿孔仪安全操作及保养规程1. 引言细胞电融合电穿孔仪是一种用于细胞电融合和电穿孔实验的专用仪器。
正确的操作和保养细胞电融合电穿孔仪对实验结果的准确性和仪器的寿命至关重要。
本文将介绍细胞电融合电穿孔仪的安全操作方法和保养规程，以确保仪器的稳定性和实验室人员的安全。
2. 安全操作规程在使用细胞电融合电穿孔仪之前，务必仔细阅读和遵守以下安全操作规程：2.1 仪器安装•在安装细胞电融合电穿孔仪之前，确保工作台面平稳、干净整洁，以确保仪器的稳定性和安全性。
•将仪器放置在通风良好的地方，远离易燃物和可燃气体，以防止发生火灾或爆炸事故。
•确保电源线和其他连接线符合安全规范并正常连接，确保电路稳定可靠。
•仪器上的开关和控制按钮应合理设置并易于操作。
2.2 个人防护在操作细胞电融合电穿孔仪时，务必采取适当的个人防护措施，以防止意外受伤。
•必须戴好实验室必备的个人防护用具，如实验手套、实验眼镜等。
•避免戴饰品，以防止其被仪器零部件卡住或引起其它危险。
•长发必须绑起来，以防止被仪器零部件绊到。
2.3 实验操作正确的实验操作是确保仪器正常运行和实验顺利进行的关键。
•严格按照操作手册上的实验步骤进行操作，避免盲目操作。
•注意操作仪器时的稳定性，以免仪器倾倒或发生意外。
•当进行高压操作时，确保操作平台上无水珠或水滴，以防触电事故。
•在实验过程中，禁止触摸仪器的电源、高压电极和高压导线等部件，以防电击事故。
2.4 实验结束后实验结束后，应按照以下步骤进行安全处理：•关闭细胞电融合电穿孔仪的电源开关，切断供电。
•将高压电源关闭，并断开与仪器的连接。
•将仪器的工作平台清洁干净并做好记录，以便下次使用。
•将实验室清理干净，确保没有任何潜在危险。
3. 保养规程正确的保养细胞电融合电穿孔仪有助于延长其使用寿命并保持仪器的性能稳定。
3.1 清洁细胞电融合电穿孔仪的外部•使用柔软的湿布清洁仪器的外壳，避免使用过多的水分或化学溶液，以防水进入仪器内部。
细胞培养实验集合
实验一培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件1、温度条件（37 ＋0.5）2、pH条件（7.2-7.4）3、气体条件4、水的质量（三蒸）5、渗透压6、营养条件7、无菌条件℃二、培养基的分类1、平衡盐液2、天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸钠 .0.11 g3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000 mL四、过滤出菌电磁搅仪器：不锈钢正压滤器材料：纤维素微孔虑膜（0.22 mm 孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象。
所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。
细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。
一、实验目的1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点；3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。
二、实验条件本实验在细胞工程实验室完成。
1、需要提供CO2培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。
大肠杆菌fc融合蛋白技术(3篇)
第1篇一、融合蛋白的概念融合蛋白是指将两个或多个蛋白质的编码序列连接起来，形成一个新的蛋白质。
这种蛋白质通常包含两个或多个蛋白质的活性区域，从而具有多种功能。
融合蛋白在蛋白质研究、生物制药等领域具有重要意义。
二、大肠杆菌表达融合蛋白的优点1. 成本低：大肠杆菌是一种易于培养的微生物，实验成本低，适合大规模生产。
2. 操作简便：大肠杆菌表达系统具有成熟的技术和操作方法，便于研究人员掌握。
3. 表达量大：在大肠杆菌中，融合蛋白的表达量较高，有利于后续纯化和鉴定。
4. 稳定性高：融合蛋白在大肠杆菌中表达稳定，易于分离纯化。
5. 研究周期短：从基因克隆到融合蛋白表达，整个过程耗时较短。
三、大肠杆菌表达融合蛋白的步骤1. 基因克隆（1）设计融合蛋白基因：根据蛋白质的功能和结构，设计融合蛋白基因，将目标蛋白基因与载体连接。
（2）构建表达载体：选择合适的表达载体，如pET-28a、pET-32a等，将融合蛋白基因克隆到载体中。
2. 转化大肠杆菌（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌菌株（如BL21）接种于LB培养基中，培养至对数生长期。
（2）制备重组质粒：将构建好的表达载体与感受态细胞混合，进行电穿孔或热击处理。
（3）涂布平板：将处理后的细胞涂布于含有抗生素的LB平板上，培养过夜。
3. 融合蛋白表达（1）挑取单克隆：从涂有抗生素的平板上挑取单克隆，接种于LB液体培养基中。
（2）诱导表达：在液体培养基中添加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）等诱导剂，使融合蛋白在大肠杆菌中表达。
（3）收集表达产物：表达一定时间后，收集大肠杆菌细胞，进行破碎和蛋白质提取。
4. 融合蛋白纯化（1）亲和层析：利用融合蛋白中特定标签（如His标签）与亲和层析柱的结合，分离纯化融合蛋白。
（2）凝胶过滤：通过凝胶过滤层析，进一步纯化融合蛋白，去除其他杂质。
（3）SDS-PAGE电泳：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定其纯度和分子量。
5. 融合蛋白活性检测（1）酶活性检测：通过检测融合蛋白的酶活性，评估其功能。
胚胎细胞融合仪器安全操作及保养规程
胚胎细胞融合仪器安全操作及保养规程胚胎细胞融合技术简介胚胎细胞融合技术是一种用于生物学研究、动物育种和植物育种的核移植技术。
它将一个细胞的核移植到另一个细胞中，从而创建一个“合成细胞”。
该技术有助于研究基因调控、发育和疾病等方面的生物学问题。
胚胎细胞融合技术还可以用于将遗传物质进行改良，从而创造出新的物种或改良现有物种。
胚胎细胞融合仪器简介胚胎细胞融合仪器是用于胚胎细胞融合的设备。
一般来说，这些设备使用焊接电流、电极和电流控制系统，将两个或更多细胞的核融合在一起。
胚胎细胞融合仪器通常使用在细胞实验室或育种中心。
使用胚胎细胞融合仪器需要谨慎，因为使用不当可能会对安全造成威胁，甚至导致人身伤害或严重事故。
胚胎细胞融合仪器的安全操作规程为了确保胚胎细胞融合仪器的安全操作，需要遵循以下操作规程：1.掌握仪器使用基础知识在使用胚胎细胞融合仪器之前，必须仔细阅读并理解设备的说明书。
操作人员必须了解设备的主要组件和工作原理，以及如何正确地连接它们。
2.检查设备的运行状态在每次使用胚胎细胞融合仪器之前，都必须仔细检查设备的运行状态。
检查设备的电气部件是否正常，如是否有破损或磨损。
确认设备是否电源连接正确，电压是否符合要求。
3.佩戴个人防护装置在进行胚胎细胞融合实验时，必须佩戴适当的个人防护装置，如手套、安全镜片和实验室外套等。
这些装置可以减少操作人员可能暴露在危险物质或条件下的风险。
4.保持整洁与卫生保持实验室的清洁和卫生是防止危险事故的重要一环。
要尽可能减少实验室里的“杂乱”，例如不要在实验台上留下危险物质或杂物，以减少错误操作的风险。
5.妥善处理废弃物和化学试剂在进行胚胎细胞融合实验期间，必须采取适当的方法来处理废弃物和化学试剂。
特别是有毒或腐蚀性试剂需要格外注意。
操作人员必须知道如何妥善处理实验室废液和实验盒，以减少污染和危险物质暴露的风险。
6.严格遵守实验室安全制度在进行胚胎细胞融合实验时，必须严格遵守实验室安全制度。
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细胞融合一、实验材料手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。
二、实验所配试剂1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。
青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。
1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。
HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。
HA T培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HA T溶液（使用前HA T有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。
GNK溶液：准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至7.2，115℃高压灭菌，4℃保存备用。
三、实验步骤1.免疫小鼠选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，皮下注射。
免疫程序如下：首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。
共免疫3次，每次间隔2周。
第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。
如果效价可以，在二免后的2周进行三免，最后一次免疫10天后，断尾采血，用适当的抗原进行包被，用间接ELISA检测抗体效价，效价达到1:1600以上即可进行细胞融合。
超强免疫：最后一次加强免疫后2周，细胞融合前3~5天，尾静脉或腹腔注射50μg纯抗原。
2. 饲养细胞的制备融合前1-2 d制备饲养细胞。
取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供筛选时用该血清做阴性对照），75%酒精消毒体表，无菌手术剪刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。
然后用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔，轻轻压挤腹部，重新吸出注入的液体（在吸取过程中为防止污染，避免针头刺破肠管），收取小鼠腹腔巨噬细胞。
用HAT稀释至40ml，100uL/孔添加到4块96孔细胞培养板中，置37℃5% CO2培养箱中培养，第二天检查有无污染情况。
3. 细胞计数为保证NS0细胞在融合时达到最佳状态和高活力，建议在融合时前一天给所需的每瓶NS0细胞换液，以备融合时使用。
80%左右NS0的细胞计数（三次平均数）：（11.6×105+9×105+3.7×105）/3=8.1×105/mL脾细胞计数6.5×106/mL,大约是40mL有 2.6×108个细胞，两次计数相差不大，所以脾细胞数可固定为2.6×108个/40mL。
NS0细胞计数：3.7×105个/mL（70%）9×105个/mL（80%）11.6×105个/mL（90%）脾细胞计数：4. 细胞融合在40℃水浴中预热GNK溶液、PEG和HA T溶液；免疫小鼠采血并分离血清，然后致死浸泡到酒精中；收集NS0细胞于50 mL离心管中（为保证高融合率建议大于4瓶90%的NS0细胞），1000 r/min离心10 min，弃上清，用GNK洗一次；5小鼠脾细胞的制备依次剪开小鼠皮肤，腹膜暴露腹腔（建议为防止污染，建议至少用两套手术刀具，一套用于剥开小鼠外部皮肤和腹膜，另一套用于取出小鼠脾脏），取脾脏放置与尼龙纱布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾细胞于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团；将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团（充分打散细胞团，以保证融合时的高融合率）；为保证融合时的温度可以事先将混匀好的细胞在40℃水浴预热两分钟，然后在另一刚取出的40℃水浴烧杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管将预热的50%PEG（pH8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1min或80s内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5min。
立即缓慢滴加37℃预热的GNK溶液15mL。
加入步骤为：1 mL/30s，3 mL/30s，11 mL/30s。
然后慢慢补加GNK溶液至40mL，37℃水浴静置5min，1000 r/min离心10 min，弃上清。
打散细胞团，加40mL HA T完全培养具吹打混匀，加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃5% CO2培养箱中培养。
克隆细胞的筛选、转孔及亚克隆一、融合细胞的培养1、融合后的细胞置于CO2培养箱中培养，次日检查有无污染，如发现污染立即滴加1%的NaOH。
2、一般2～3d可见小克隆；7d时于出现克隆的孔内半量换液（注意：37℃预热HA T培养基）；3、10d左右可以吸取少量上清用于筛选（一般吸取50～100µL），并补加等量的HA T培养基（换液时应轻柔，以减少对克隆细胞的损伤）；4、14d左右对所筛选的阳性孔可半量更换HT培养基，同时对筛选阳性孔的细胞转至24孔培养板中扩大培养，准备克隆化。
在筛选过程中将HA T培养基逐渐更换为完全培养基RPMI1640/10。
二、筛选（1）包被。
将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量，如果是纯化病毒根据病毒的浓度做1:400-1000倍稀释）。
每孔的包被体积为50ul。
37℃包被2h或4℃包被过夜。
（2）封闭。
倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，5% 脱脂牛奶（PBST 溶解）或其它无关物种血清于37℃封闭2h，封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4℃密封保存以备后面使用。
（3）一抗。
封闭完后，弃去孔内液体，拍干，用封闭液1:1稀释待检测克隆孔上清，每孔50ul为宜。
同时做阳性（融合小鼠血清1:500-1000倍稀释）和阴性（所制备饲养细胞小鼠血清1:200倍稀释）及空白对照（所稀释抗体用封闭液）和无克隆孔上清对照。
在每块板子上做好标记。
37℃孵育30min。
（4）二抗。
孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。
根据二抗说明稀释二抗至适当比例，每孔加入50ul，37℃孵育30min。
（5）显色。
孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂，37℃显色5-10min，拍照记录检测结果，筛选出阳性较强的克隆进行特异性检测。
三、特异性筛选对筛选的强阳性克隆孔进行特异性筛选，如果是用大肠杆菌表达的蛋白，可以用载体蛋白、正常大肠杆菌上清以及其它无关蛋白进行包板检测；如果是细胞毒免疫的可以用正常细胞的裂解液包板检测；如果是组织毒免疫的可以用正常动物组织包板检测。
其检测方法同上，注意设立对照组。
同时对筛选的特异性较强的阳性孔转至24孔培养板中扩大培养，准备克隆化。
四、阳性细胞的转孔1、为保证转孔成功，建议当96孔板细胞长至80%时转孔。
2、按常规方法转孔前一天制备饲养细胞，24孔板每孔加入0.5-1ml 的饲养细胞悬液，第二天检查有无污染情况。
（转孔时所用培养基和转孔前所用培养基应保持一致）。
3、收集待转孔的阳性细胞上清，做好标记保存备用，添加已预热的HA T和HT培养基1:1混合（因此时96孔板克隆已半量过度到HT 培养基）各100ul/孔。
4、用200ul移液器轻轻吹下细胞，为减少对克隆细胞的刺激，吹打过程应轻柔，然后将细胞悬液加入至24孔板中，为保证细胞均匀分布到板底，可以用振荡器轻轻混匀，做好标记。
同时，对所转孔细胞补加新的培养基，保留原始孔以避免转孔失败。
五、转孔后的检测当转孔后细胞长至50%时，用ELISA检测方法及时进行效价检测和特异性检测，检测方法同上，筛选出效价高和特异性较强的准备亚克隆。
同时在筛选过程中对24孔板的细胞逐步更换至1640完全培养基。
六、杂交瘤细胞的克隆为保证克隆细胞的活性和数量，建议当待克隆的细胞孔长至80%时进行有限稀释。
提前一天制备饲养细胞，收集待转孔细胞的培养上清保存备用，加入已预热1640不完全培养基1ml（其目的是该孔细胞被有限稀释后可以冻存该孔细胞。
冻存方法为：直接吸取500 ul 该孔细胞悬液，再加入400 ul胎牛血清和100 ul DMSO混匀，1ml/管，做好标记，按照正常程序冻存细胞），轻轻吹打混匀细胞，取出少许细胞悬液进行计数，采用有限稀释法对阳性孔的融合细胞进行克隆化。
其步骤如下：1、用10ul台盼蓝和10ul细胞悬液于PCR管中等比例混合后，在显微镜下进行活细胞计数根据公式：细胞数/mL = N/4 ×103×10×稀释倍数（N为显微镜下四角4个大方格的活细胞总数）来计算每毫升细胞悬液所含的活细胞数，然后取适量的细胞悬液，用1640培养基（此时24孔板克隆细胞过度到那种培养基就用那种培养基做有限稀释）稀释到10mL，并且要含有2×103个活细胞（稀释度Ⅰ）；2、取1mL稀释度Ⅰ的细胞悬液加9mL1640完全培养基（稀释度Ⅱ）；3、取3mL稀释度Ⅱ的细胞悬液加7mL1640完全培养基（稀释度Ⅲ）；4、用稀释度Ⅰ的细胞悬液铺板半块96孔板，100µL/孔，20个细胞/孔；用稀释度Ⅱ的细胞悬液铺板另半块96孔板，100µL/孔，2个细胞/孔；用稀释度Ⅲ的细胞悬液铺一块96孔板，100µL/孔，0.6个细胞/孔；5、将上述培养板置于CO2培养箱中培养，培养7d后，对单克隆孔进行标记并半量换液，当单克隆长至孔底的1/10时，进行效价检测和特异性检测，筛选出特异性较高和阳性较强的细胞进行重复克隆；6、同时每次将克隆剩余细胞转入24孔细胞培养板培养（并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡），继而转入6孔板或细胞中进行扩大培养，并及时冻存；经过多次克隆操作，直至所有克隆的细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。